杜東霞

(菏澤學院生命科學系，山東 菏澤 274015)

微生物的生長繁殖，需要不斷地從外界汲取必需的碳源、氮源、無機鹽、微量元素、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)能夠為微生物提供能量、結構物質(zhì)、代謝調(diào)節(jié)因子等，如果缺少其中的一種或幾種，就會產(chǎn)生短板效應，微生物就不會生長.碳源在微生物體內(nèi)經(jīng)過一系列復雜的化學變化能夠為有機體的各種生理活動提供所需的能量，微生物能夠利用的碳源有糖類、醇類、醛類、有機酸類和脂類等，其中糖類是應用最廣泛的碳源.為了確定不同微生物對不同碳源的利用程度，可以將每種微生物和缺少碳源的合成培養(yǎng)基制作混菌平板，然后將各種碳源利用打孔法、糖浸片法和糖粒法點植于混菌平板上，隨著該營養(yǎng)物在植點周圍擴散，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，在營養(yǎng)物的擴散處微生物開始生長繁殖，并使指示劑變?yōu)辄S色，可以根據(jù)變黃范圍的大小初步判斷該微生物對不同碳源的利用程度.由于該方法能夠使微生物生長之處出現(xiàn)生長圖形，因而稱之為生長譜法.該方法在生物教學中廣泛用于各種微生物對不同營養(yǎng)需求的定性和定量的研究［1～5］.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌(Escherichia coli);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);普通變形桿菌(Proteus vulgaris);金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).

1.1.2 合成培養(yǎng)基

先將100 g黃豆芽在1 L蒸餾水中煮沸約30 min，用4層紗布過濾，然后取其汁液10 mL，20 g瓊 脂，1 g(NH4)3PO4，0.2 gKCl，0.2 g MgSO4·7H2O，放入燒杯中，加蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié) pH值至7.0.最后加入約24 mL質(zhì)量分數(shù)為0.04%的溴甲酚紫作指示劑(pH 5.2 ～ pH 6.8，顏色由黃色變?yōu)樽仙?，在121℃下滅菌20 min.

1.1.3 糖類

葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖及其圓形濾紙?zhí)墙?6種糖分別編號為 A，B，C，D，E，F(xiàn)).

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng).

1.2.2 制備菌懸液

在無菌條件下，用接種環(huán)分別刮取四種斜面菌落于無菌水中制備菌懸液.

1.2.3 制備混菌平板

將固體合成培養(yǎng)基斜面加熱融化后，冷卻至50℃ 左右，每支加入1 mL菌懸液，充分混勻后分別制備大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌混菌平板.

1.2.4 制作糖浸片

用圓形打孔器制備直徑約為0.4 cm的圓形濾紙片，在不同糖的飽和溶液中浸泡10 min，在紫外燈下照射20～30 min至完全干燥.

1.2.5 混菌平板分區(qū)植糖

分別在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌的混菌平板(每種平板3個，分別編號為甲、乙和丙)背面劃分6個均勻的植糖區(qū)域，如圖1所示.現(xiàn)以大腸桿菌為例，先用接種環(huán)分別挑取6種糖粒(小米粒大小)點植于大腸桿菌甲混菌平板的相應區(qū)域;接著用無菌鑷子夾取6種不同的糖浸片，點植于大腸桿菌乙混菌平板的相應區(qū)域;大腸桿菌丙混菌平板的相應區(qū)域用打孔器打孔，每孔注入30 μL相應的飽和糖溶液.

圖1 混菌平板背面均勻分布的6個植糖區(qū)域

1.2.6 培養(yǎng)及觀察

置糖混菌平板37℃先正面培養(yǎng)2 h，再倒置培養(yǎng)過夜，觀察不同方法的實驗效果.

2 結果

2.1 大腸桿菌碳源譜結果比較

大腸桿菌碳源譜實驗結果，如圖2所示.

圖2 三種方法大腸桿菌碳源譜結果比較

指示劑溴甲酚紫會使生長區(qū)域變?yōu)辄S色，圖2a采用糖粒法，變黃現(xiàn)象不明顯，而且變色圈很容易相互交叉重疊;圖2b采用糖浸片法，該方法一定程度上要優(yōu)于糖粒法，但是效果還不夠明顯;圖2c采用打孔法，效果很明顯，該方法優(yōu)于糖粒法和糖浸片法.

2.2 四種微生物碳源譜的結果比較

利用打孔法鑒定的四種微生物對不同糖類的利用程度，見表1.

表1 四種微生物對不同糖類的利用

3 討論

和傳統(tǒng)的糖粒法和糖浸片法相比較，改進的打孔法為不同微生物各種營養(yǎng)物質(zhì)利用程度的測定提供了一種新方法，該方法具有如下優(yōu)點.

首先，該方法簡單易行，雖然糖粒法操作也簡易，但糖粒的點植比較困難，難免在點植的周圍散落糖粉，再者糖粒的大小也不好控制，很難達到大小一致，這就造成點植糖量的不均一;糖浸片法操作較繁雜，不好定量，而且不易于糖份在平板上的擴散，倒置培養(yǎng)容易從平板上脫落.而打孔法不但操作簡易，而且容易定量，效果顯著.

其次，實驗結果準確可靠，相對于糖粒法和糖浸片法，打孔法定量植入，而且擴散快，反應迅速，效果明顯，避免了傳統(tǒng)方法定量和擴散上的困難.

最后，易于嚴格的無菌操作，可以大大降低雜菌的污染.對比實驗表明，糖粒法污染較為嚴重，糖浸片法次之，而打孔法將污染降到了最低，而且效果顯著，能夠在實驗教學中大幅度提高生長譜測定的成功率.

［1］辜建平，張慶，劉邦芳，等.微生物生長譜法實驗技術的改進與探析［J］.微生物學通報，2005，32(1):90－93.

［2］康振，耿艷平，張園園，等.好氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸工程菌株的構建［J］.生物工程學報，2008，24(12):2081－2085.

［3］沈萍.微生物學實驗［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］周德慶.微生物學實驗教程［M］.北京:高等教育出版社，2006.

［5］方德華，魏新元，申鴻.微生物實驗技術［M］.北京:高等教育出版社，2000.