李永仁 董少杰 陳麗梅 楊 廣

黃顙魚三倍體人工誘導(dǎo)方法的比較研究

李永仁 董少杰 陳麗梅 楊 廣

（天津農(nóng)學(xué)院a．水產(chǎn)科學(xué)系，b．天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

應(yīng)用熱休克、冷休克、6－DMAP和CB處理黃顙魚受精卵，探討誘導(dǎo)三倍體的適宜方法．4種方法均能誘導(dǎo)黃顙魚受精卵形成三倍體胚胎．受精卵經(jīng)熱休克處理（受精后第8min，40℃處理2min），誘導(dǎo)率為93．3%，孵化率為78．6%；冷休克法（受精后第3min，4℃處理15min）誘導(dǎo)率為63．3%，孵化率為82．3%；受精卵經(jīng)6－DMAP和CB處理得到的誘導(dǎo)率較低，分別為26．7%和10．0%．綜合考慮，熱休克法及冷休克法為誘導(dǎo)黃顙魚三倍體的適宜方法．

黃顙魚；三倍體；誘導(dǎo)

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）俗稱黃臘丁、黃鼓魚等，屬鯰形目、鲿科、黃顙魚屬［1］，是目前國(guó)內(nèi)重要淡水養(yǎng)殖魚類，具有較好的市場(chǎng)前景［2］．但是，由于該魚生長(zhǎng)速度慢、個(gè)體規(guī)格偏小，影響了該品種養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益．人工誘導(dǎo)的三倍體魚具有不育、個(gè)體大、生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、肉質(zhì)好、成活率高等優(yōu)良品性［3］，因此，有望利用三倍體誘導(dǎo)技術(shù)培育出優(yōu)質(zhì)黃顙魚苗種．

國(guó)內(nèi)外通過多種方式對(duì)不同魚類開展了三倍體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：楊彩卿等［4］應(yīng)用6－DMAP誘導(dǎo)三倍體黃顙魚；宋立民等［5］應(yīng)用冷、熱休克法誘導(dǎo)三倍體黃顙魚；尤鋒［6］利用冷休克法誘導(dǎo)黑鯛三倍體；林琪、桂建芳等［7－8］應(yīng)用靜水壓休克法分別對(duì)大黃魚和水晶彩鯽開展三倍體誘導(dǎo)；Ojima、Peter等［9－10］應(yīng)用溫度休克法獲得了鯉魚和美洲紅點(diǎn)鮭三倍體．

本文應(yīng)用冷休克、熱休克、6－DMAP以及CB等不同處理方式，誘導(dǎo)黃顙魚三倍體，以期選擇實(shí)用、高效的三倍體誘導(dǎo)方法．

1 材料與方法

1．1 材料

黃顙魚親魚取自天津市漳河水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖池，2齡，雌雄各30尾，雌魚體重98±18g，雄魚體重158±28g，性腺發(fā)育良好．

誘導(dǎo)試劑：6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）、細(xì)胞松弛素B（CB），均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

親魚注射絨毛膜促性腺激素（HCG）＋馬來(lái)酸地歐酮（DOM），20h后擠壓取卵，解剖取精，并進(jìn)行人工授精．受精卵均勻散布于60目網(wǎng)片上，每個(gè)網(wǎng)片作為一組進(jìn)行處理．

受精卵經(jīng)過溫度休克及藥物處理過程誘導(dǎo)三倍體，其中熱休克法設(shè)3個(gè)溫度梯度，3個(gè)起始時(shí)間梯度和3個(gè)持續(xù)時(shí)間梯度．每組設(shè)平行，具體操作見表1．

1．2．2 倍性鑒定

受精150d后，幼魚體長(zhǎng)達(dá)7～10cm，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)倍性．具體方法為：每組取幼魚30尾，尾柄取血，多聚甲醛固定，自然沉降；吸除上清，懸浮于PBS；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．1%triton X－100透化處理20min，10mg／L PI染色30min；離心棄上清，血細(xì)胞懸浮于PBS，細(xì)胞終濃度106～107個(gè)／mL．以流式細(xì)胞儀（美國(guó)Betecton Dickinson公司FACS tar Puls）于波長(zhǎng)488nm下檢測(cè)細(xì)胞DNA相對(duì)含量，處理組樣品若為對(duì)照組樣品DNA含量的

1．5倍，即可判定為三倍體．

1．3 數(shù)據(jù)處理

不同處理組受精卵分別培育，統(tǒng)計(jì)受精率、孵化率、畸形率以及三倍體誘導(dǎo)率等數(shù)據(jù)．

受精率為原腸期存活胚胎數(shù)與總卵數(shù)之比；孵化第2天統(tǒng)計(jì)畸形率，畸形仔魚與孵出仔魚總數(shù)之比為畸形率；誘導(dǎo)率為三倍體仔魚數(shù)與正常仔魚數(shù)之比．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 三倍體誘導(dǎo)效果

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定黃顙幼魚二倍體和三倍體各30尾，測(cè)定結(jié)果表明：二倍體DNA相對(duì)含量為196～198、均值為196．57；三倍體DNA相對(duì)含量為278～293、均值為283．60，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定幼魚倍性的直方圖結(jié)果如圖1，橫坐標(biāo)代表單細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量．

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組分別統(tǒng)計(jì)受精率、孵化率、畸形率以及三倍體誘導(dǎo)率，結(jié)果如表1．

表1 各實(shí)驗(yàn)組胚胎發(fā)育及三倍體誘導(dǎo)率Tab．1 Embryo development and triploid inductivity in test groups

2．2 誘導(dǎo)方法的選擇

如表1所示，在熱休克各組中，42℃處理組胚胎沒有孵出仔魚；38℃處理組雖然孵化率較高，但倍化率低；6min處理組倍化率較低，10min處理組孵化率低，且新生仔魚畸形率較高；在處理持續(xù)時(shí)間方面，2min組優(yōu)于3min組．因此，應(yīng)用熱休克法誘導(dǎo)黃顙魚三倍體的適宜條件為受精8min后，40℃溫水中處理2min，倍化率達(dá)到93．3%，是黃顙魚三倍體誘導(dǎo)的最佳方法．

冷休克組倍化率低于熱休克組，為63．3%，但孵化率較高，達(dá)82．3%，較適于黃顙魚三倍體誘導(dǎo)．誘導(dǎo)劑對(duì)比發(fā)現(xiàn)，6－DMAP處理組與CB處理組不但誘導(dǎo)率低、孵化率低，而且畸形率高，加之藥品價(jià)格昂貴，不適于開展大規(guī)模誘導(dǎo)．

圖1 二倍體及三倍體黃顙魚DNA的相對(duì)含量Fig．1 DNA relative content of diploid and triploid Pelteobagrus fulvidraco

3 討論

3．1 黃顙魚三倍體誘導(dǎo)的適宜方法

人工誘導(dǎo)魚類多倍體的常用的方法是溫度休克和靜水壓休克，由于靜水壓休克設(shè)備要求高，目前的報(bào)道以溫度休克為多．熱休克方法首次被用來(lái)處理三刺魚卵，獲得了三倍體成魚［11］；隨后，在鱘魚、虹鱒和羅非魚方面也獲得了三倍體［12－14］．冷休克方法：采用受精3min的三棘刺魚卵，0℃休克1．5～3．0h，獲得了三倍體幼魚［11］；對(duì)受精10min后的鯉魚卵采用0℃休克10min，獲得了三倍體幼魚及成魚［9］；以4～5℃水在受精后5min處理黑鯛受精卵10～15min，從而獲得三倍體［6］．本實(shí)驗(yàn)表明，熱休克及冷休克處理黃顙魚受精卵均能在胚胎發(fā)育基本正常的前提下獲得較高的三倍體誘導(dǎo)率．條件適當(dāng)?shù)臒嵝菘颂幚硎裹S顙胚胎倍化率達(dá)到了90%以上，超過其他任何誘導(dǎo)方式，為黃顙魚三倍體誘導(dǎo)的適宜方法．冷熱休克均能對(duì)黃顙受精卵第二極體（PB2）的釋放產(chǎn)生抑制，這可能與黃顙魚屬溫水性魚類有關(guān)［3］．

6－DMAP為嘌呤毒素類似物，能夠抑制蛋白質(zhì)磷酸化，通過作用于特定的酶，破壞微管聚合中心，阻止紡錘體形成，從而抑制極體釋放［15］．6－DMAP作為誘導(dǎo)劑廣泛應(yīng)用于貝類和魚類多倍體的誘導(dǎo)［3，15］．楊彩卿等［4］應(yīng)用6－DMAP誘導(dǎo)黃顙魚三倍體，得到與本實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，但倍化率較低．CB是誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物多倍體的一種常用藥物，它的作用機(jī)理是通過阻遏新微絲的形成，促進(jìn)舊微絲解聚，使細(xì)胞分裂末期的收縮環(huán)難以形成，進(jìn)而造成極體不能釋放，染色體加倍［16］．CB毒性較大，且有致癌性，水溶性較差，價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模生產(chǎn)［3］．本實(shí)驗(yàn)表明，以CB誘導(dǎo)黃顙魚三倍體，畸形率高、孵化率低、倍化率低．

3．2 黃顙魚三倍體誘導(dǎo)的特點(diǎn)

常重杰等［17］應(yīng)用熱休克法對(duì)黃鱔的三倍體誘導(dǎo)率超過90%，靜水壓法對(duì)鳙魚三倍體的誘導(dǎo)率為80%～100%［18］，而該實(shí)驗(yàn)表明，熱休克誘導(dǎo)黃顙魚三倍體最高為93．3%，與其他三倍體誘導(dǎo)的魚類相比，黃顙魚的誘導(dǎo)率較高．

必須指出，在開展冷、熱休克法黃顙魚三倍體誘導(dǎo)得到高誘導(dǎo)率的同時(shí)，也容易造成較高的胚胎畸形率：40℃熱休克造成的畸形率為32．5%～68．5%，冷休克法的畸形率為53．0%，CB處理組畸形率高達(dá)82．3%．因此，選擇適宜的誘導(dǎo)方式不應(yīng)僅考慮誘導(dǎo)率1個(gè)因素．

對(duì)黃顙魚開展三倍體誘導(dǎo)時(shí)，溫度休克的誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于化學(xué)藥物．6－DMAP與CB大量應(yīng)用于貝類多倍體誘導(dǎo)［19］，貝類三倍體誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于其對(duì)黃顙魚的誘導(dǎo)率．推測(cè)原因可能為：硬骨魚類受精卵體積遠(yuǎn)大于貝類受精卵，且具有殼膜等附屬保護(hù)性構(gòu)造，導(dǎo)致在藥物處理時(shí)，受精卵內(nèi)藥物濃度較低，無(wú)法有效抑制PB2的釋放．

受精卵發(fā)育同步性是提高三倍體誘導(dǎo)效率的關(guān)鍵［19］，因此魚卵的質(zhì)量與受精同步性尤為重要．實(shí)驗(yàn)過程中，6月上旬魚卵質(zhì)量較好，以后次之；注射激素后19～20h催產(chǎn)較好，時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致卵子過熟；精子在生理鹽水中不能久存，用剛解剖出來(lái)的精子進(jìn)行授精最好．

借助人工干預(yù)受精過程的方法，誘導(dǎo)黃顙魚三倍體，受人工授精和誘導(dǎo)技術(shù)的限制，容易造成較高的畸形率和較低的孵化率，且誘導(dǎo)率難以達(dá)到100%．多倍體育種實(shí)踐表明，四倍體和二倍體雜交可生產(chǎn)100%三倍體［20］，若人工誘導(dǎo)四倍體成功，將可探討通過四倍體和二倍體雜交產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)三倍體的可能性．

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（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）

Comparative study on triploid inducement methods in Pelteobagrus fulvidraco

LI Yong－ren，DONG Shao－jie，CHEN Li－mei，YANG Guang
（a．Department of Fishery Sciences，b．Tianjin Key Laboratory of Aqua－ecology and Aquaculture，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China）

Heat shock，cold shook，6－DMAP and CB were used for triploid inducement in Pelteobagrus fulvidraco to ascertain a feasible method．The result indicated that all the four methods can induce triploid embryo from zygotes．The induction rate and hatching rate were 93．3%and 78．6%respectively from the zygotes treated by heat shock for 2minutes with 40℃water after fertilization 8minutes，and cold shock for 15minutes with 4℃water after fertilization 3minutes cause 63．3%of induction rate and 82．3%of hatching rate．Lower induction rate were 26．7%and 10．0%from the zygotes treated by 6－DMAP and CB respectively．In balance，the feasible methods for triploid inducement in Pelteobagrus fulvidraco were heat shock and cold shock．

Pelteobagrus fulvidraco；triploids；inducement

book=2012,ebook=77

Q953．3

A

1671－1114（2012）02－084－04

2011－08－31

天津市基礎(chǔ)研究與前沿計(jì)劃資助項(xiàng)目（08JCYBJC27800）；天津市教委基金資助項(xiàng)目（2008ZD21）．

李永仁（1978－），男，講師，從事水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種方面的研究．

楊 廣（1965－），男，教授．主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖與病害防治方面的研究．