李小飛 ，張 帆 ，顧 倩 ，汪向明 ，劉銀華 ，馬少平，李佳嘉

(1.南陵縣人民醫(yī)院 病理科，安徽 蕪湖 242400;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 病理科，安徽 蕪湖 241001;3.皖南醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;4.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001)

卵巢交界性腫瘤又稱低度惡性潛能腫瘤，1929年由Taylor 首次提出，1971年被國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)列入卵巢腫瘤分類，成為獨(dú)立的臨床和病理學(xué)類型。BOTs 占全部卵巢腫瘤的10%～20%，發(fā)病年齡多在20～40歲之間。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)BOTs 的病理學(xué)特性、名稱，生物學(xué)行為以及治療方案已進(jìn)行了較多研究，但至今尚未達(dá)成共識(shí)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員［1］。近年來(lái)有研究表明，b-FGF 與腫瘤的關(guān)系特別是與腫瘤血管生成的關(guān)系密切，并通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等因素促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，與腫瘤的生物學(xué)行為、治療的敏感性等因素密切相關(guān)。

研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)可分為無(wú)血管期和血管期，在無(wú)血管期腫瘤直徑不超過(guò)1～2 mm;而至血管期，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)新生毛細(xì)血管并獲得進(jìn)一步生長(zhǎng)的能力。所以說(shuō)血管的形成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要［2］。腫瘤的血管形成通常用腫瘤內(nèi)微血管密度來(lái)表示，它是決定腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要因素。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于b-FGF 與卵巢交界性腫瘤的研究少見(jiàn)報(bào)道。我們以免疫組化方法檢測(cè)BOTs 組織中b-FGF、CD34 的表達(dá)，探討b-FGF 的表達(dá)與腫瘤血管形成的關(guān)系，為BOTs 診治、預(yù)后及臨床分期提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 標(biāo)本選自皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院2008年1月～2010年1月經(jīng)手術(shù)切除的卵巢交界性腫瘤組織57 例，平均年齡(43.2 ±9.2)歲，所有標(biāo)本術(shù)前均未進(jìn)行放化療。臨床分期按FIGO標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期41 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期9 例。57 例中腹腔非浸潤(rùn)性種植2 例，腹腔浸潤(rùn)性種植3 例。另取同期31 例卵巢上皮性惡性腫瘤，平均年齡(52.3 ±12.7)歲;25 例卵巢上皮性良性腫瘤，平均年齡(38.5 ±7.1)歲;17 例正常卵巢組織，平均年齡(42.2 ±11.8)歲為對(duì)照組，其中正常卵巢組織來(lái)源于子宮肌瘤行附件切除術(shù)的患者。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，每份蠟塊切成4 μm 厚切片。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法 采用免疫組化SP 染色法檢測(cè)不同種類卵巢組織中b-FGF 的表達(dá)。免疫組化染色按說(shuō)明書(shū)操作，以PBS 代替一抗為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2 試劑 鼠抗人單克隆抗體b-FGF、鼠抗人單克隆抗體CD34(北京中杉生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);二步法鼠抗人免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)。

1.2.3 結(jié)果判定 b-FGF 以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性判斷依據(jù)腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)綜合評(píng)價(jià)。用免疫組化半定量積分法計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍視野(400 倍)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，總共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞。先按染色強(qiáng)度打分:基本不著色為0分，淡黃色為1 分，棕色為2 分，深棕色為3 分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分;兩種評(píng)分相乘得分:0～1 分為陰性(－)，2～3 分為弱陽(yáng)性(+)，4～6 為陽(yáng)性(■)，6 分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(■)。

MVD 計(jì)數(shù)方法:CD34 陽(yáng)性以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色染色為標(biāo)準(zhǔn);血管計(jì)數(shù)以被染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1 個(gè)血管計(jì)數(shù);只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計(jì)作一個(gè)血管計(jì)數(shù)。腫瘤內(nèi)硬化區(qū)及與腫瘤交界處軟組織內(nèi)的微血管，有厚的平滑肌及血管直徑＞8 個(gè)紅細(xì)胞的微血管除外;每一標(biāo)本先低倍鏡(×100)下選3 個(gè)微血管數(shù)最多的區(qū)域即“熱點(diǎn)”，在每一個(gè)區(qū)域中計(jì)數(shù)一個(gè)高倍鏡(×200)下的微血管數(shù)，取其均值計(jì)為MVD［3］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)采用Spearman 分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中b-FGF 的表達(dá) b-FGF 蛋白在BOTs、正常卵巢組織、卵巢良性腫瘤和惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，分別為54.4%、11.8%、24.0%、77.4%。與BOTs 相比，卵巢癌中b-FGF 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.36，P ＜0.01)。詳見(jiàn)圖1～3、表1。

表1 b-FGF 在卵巢組織中的表達(dá)［n(%)］Tab 1 Expressions of b-FGF in borderline ovarian tumor tissues，normal ovarian tissues，and both benign and malignant ovarian tumor tissues

2.2 b-FGF 蛋白的表達(dá)與BOTs 患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 根據(jù)BOTs 有無(wú)其他部位轉(zhuǎn)移，我們將臨床病理分期中Ⅰ期、Ⅱ期合并與Ⅲ期比較。BOTs組織中b-FGF 蛋白的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)類型、臨床病理分期、腹腔種植和患者年齡均無(wú)明顯關(guān)系(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 BOTs 中b-FGF 表達(dá)與MVD 的關(guān)系 b-FGF陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤組織MVD 值高于b-FGF 陰性腫瘤組織MVD 值，t=38.82，P ＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

圖1 b-FGF 在卵巢黏液性囊腺瘤中的表達(dá)(SP×100)圖2 b-FGF 在卵巢交界性漿液性囊腺癌中的表達(dá)(SP ×100)圖3 b-FGF 在卵巢漿液性囊腺癌中的表達(dá)(SP×100)

表2 b-FGF 蛋白在卵巢交界性腫瘤中不同臨床病理情況的表達(dá)［n(%)］Tab 2 Correlation of b-FGF with clinicopathologic features for borderline ovarian tumor tissues

表3 卵巢交界性腫瘤中b-FGF 的表達(dá)與MVD 的關(guān)系Tab 3 Relationship between b-FGF and MVD in borderline ovarian tumor tissues

3 討論

Hanahan 等［4］1996年提出了血管生成的開(kāi)關(guān)平衡假說(shuō)，認(rèn)為血管生成受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控。b-FGF 是成纖維生長(zhǎng)因子家族中的一員，最初由Gospodarowiz［5］于1974年從牛腦垂體中提取的一種由146 個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子多肽生長(zhǎng)因子，它具有促進(jìn)腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6－7］。在此過(guò)程當(dāng)中，b-FGF 通過(guò)調(diào)節(jié)膠原酶、蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)和整合素(integrins)的活性，導(dǎo)致血管基膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞侵入周圍的基質(zhì)，并增殖和分化，最終形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)。Chikazawa 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌的早期階段，MVD 的增高同時(shí)伴隨著b-FGF 表達(dá)量增高，促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，并且b-FGF 的表達(dá)與膀胱癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Carmen 等［9］發(fā)現(xiàn)在肺的非小細(xì)胞癌組織中，存在b-FGF 和FGFR2 過(guò)表達(dá)，特別是在肺小細(xì)胞癌的早期階段，b-FGF 的表達(dá)活性是增高的，促進(jìn)了腫瘤血管形成。Demirkesen等［10］在黑色素瘤中的研究表明，MVD 的增高同時(shí)伴隨有b-FGF 和VEGF 表達(dá)量增高。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β))對(duì)b-FGF 誘導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，隨著濃度的升高，b-FGF 誘導(dǎo)效應(yīng)會(huì)由促進(jìn)變成抑制，同時(shí)，TGF-β 對(duì)自身也有一種反饋調(diào)節(jié)作用，最終影響b-FGF 誘導(dǎo)的新血管形成，這一調(diào)節(jié)機(jī)制有利于腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，b-FGF 與卵巢腫瘤的惡性程度、血管生成等指標(biāo)密切相關(guān)，b-FGF 可以成為卵巢癌診斷和治療的很好的靶點(diǎn)［11－12］。本研究結(jié)果顯示b-FGF 蛋白在卵巢正常組織、良性腫瘤、BOTs、惡性腫瘤中表達(dá)率分別為11.8%，24.0%，54.4%，77.4%。與BOTs 相比，卵巢癌中b-FGF 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)率下降，差異均有顯著性(P ＜0.01，P ＜0.05)，而正常卵巢組織與良性腫瘤相比，差異無(wú)顯著意義(P ＞0.05)。b-FGF 表達(dá)率在BOTs 均介于良、惡性腫瘤之間，且隨腫瘤從良性→交界性→惡性情況發(fā)展而遞增，提示b-FGF 表達(dá)與卵巢腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，另一方面也證實(shí)了卵巢交界性腫瘤是介于良、惡性卵巢腫瘤之間的一種特殊類型腫瘤。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)b-FGF 表達(dá)與BOTs 的組織學(xué)分型、臨床病理分期、腹腔種植和患者年齡均無(wú)關(guān)(P＞0.05)。本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，b-FGF 在BOTs 中的陽(yáng)性表達(dá)與高M(jìn)VD 相關(guān)，即MVD 隨b-FGF 表達(dá)增強(qiáng)而增多，說(shuō)明b-FGF 表達(dá)與腫瘤血管形成相關(guān)，以上說(shuō)明b-FGF 聚集可能是卵巢腫瘤發(fā)生的早期事件。

綜上所述，b-FGF 蛋白表達(dá)率在BOTs 中介于良、惡性腫瘤之間，且b-FGF 表達(dá)隨MVD 增多而增強(qiáng)，說(shuō)明b-FGF 能較客觀地反映卵巢腫瘤的惡性程度，并與腫瘤的血管形成密切相關(guān)，說(shuō)明抗b-FGF在BOTs 的抗腫瘤血管形成治療中的重要意義。檢測(cè)b-FGF 有助于BOTs 的早期診斷，為臨床制定恰當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┮罁?jù)，并可作為評(píng)估BOTs 腫瘤生物學(xué)行為的客觀指標(biāo)。

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