黃勝光， 盧兆山， 邱世明， 奚國(guó)華， 陸 道， 鐘恒祿

（廣西防城港出入境檢驗(yàn)檢疫局，538001）

廣西防城港首次截獲苜蓿黃萎病菌

黃勝光， 盧兆山， 邱世明， 奚國(guó)華， 陸 道， 鐘恒祿

（廣西防城港出入境檢驗(yàn)檢疫局，538001）

從一批進(jìn)境的美國(guó)苜蓿草樣品中保濕分離得到了3株與苜蓿黃萎病菌（Verticillium albo-atrum）相似的目標(biāo)菌VA1、VA2、VA3。該目標(biāo)菌在PDA上生長(zhǎng)迅速，菌絲生長(zhǎng)0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可見的菌落斑點(diǎn)；菌落為白色圓形，邊緣規(guī)則呈圓形，菌絲較致密，氣生菌絲較少，菌落中心乳白色奶凍狀；培養(yǎng)4～5d即后產(chǎn)生氣生典型輪枝狀分生孢子梗，7～8d后菌落中央表面因產(chǎn)生休眠菌絲開始變成黑褐色至黑色，20d后菌落的表面和背面大部分均變黑色，仍不產(chǎn)生微菌核和厚垣孢子。該目標(biāo)菌的純培養(yǎng)用V.albo-atrum特異引物Vaa1／Vaa2進(jìn)行檢測(cè)，PCR擴(kuò)增后得到預(yù)期330bp的產(chǎn)物片段，產(chǎn)物序列與V.albo-atrum相應(yīng)序列的相似性為100%。從而鑒定確認(rèn)該目標(biāo)菌為苜蓿黃萎病菌V.albo-atrum。

苜蓿黃萎病菌； 檢疫； 口岸截獲

致 謝： 目標(biāo)菌純培養(yǎng)送至江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，由吳翠萍、李彬復(fù)核確認(rèn)，特此致謝。

聯(lián)系方式 Tel：0770-2822708；E-mail：gxhsg＠163.com

輪枝菌的2個(gè)最重要植物寄生菌就是苜蓿黃萎病菌（Verticillium albo-atrum）和棉花黃萎病菌（V dahliaeKlebahn）［1］。其中苜蓿黃萎病菌危害大、致病力強(qiáng)是我國(guó)檢疫性真菌病害。此病最早于1918年發(fā)現(xiàn)于瑞典Hedlund，1923年－1950年基本遍布整個(gè)北歐［2］，1977年美國(guó)第一次報(bào)道發(fā)現(xiàn)苜蓿黃萎病菌［3］，從此此病在美國(guó)快速擴(kuò)展，成為許多地方苜蓿種植的一個(gè)重要限制因素［4－5］。

2010年10月下旬，防城港檢驗(yàn)檢疫局受理報(bào)檢了一批從美國(guó)進(jìn)口的苜蓿草，該批貨物共5個(gè)集裝箱，重量118.6t，貨值3.38萬(wàn)美元。檢驗(yàn)檢疫人員對(duì)該批貨物實(shí)施了現(xiàn)場(chǎng)查驗(yàn)、抽樣。樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)室保濕培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)疑似苜蓿黃萎病菌，分離純化后獲得的純培養(yǎng)，觀察和測(cè)量其形態(tài)特征，同時(shí)通過PCR檢測(cè)以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序與基因庫(kù)比對(duì)分析，確認(rèn)該批貨物含有我國(guó)禁止進(jìn)境植物檢疫性有害生物——苜蓿黃萎病菌（V.albo-atrum）。發(fā)現(xiàn)疫情后，該局根據(jù)相關(guān)規(guī)定及時(shí)出具了《檢驗(yàn)檢疫處理通知書》，對(duì)該批貨物已作監(jiān)督退運(yùn)處理?，F(xiàn)將檢疫鑒定結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)進(jìn)境紫花苜蓿干草樣品，試驗(yàn)樣品重量為5袋計(jì)5kg，陽(yáng)性對(duì)照為V.albo-atrumM1菌株（由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局吳翠萍女士提供）。

1.2 樣品保濕培養(yǎng)

盡可能地挑取枯黃的莖稈以及維管束褐變的莖稈樣品，每根莖稈剪取一段，約長(zhǎng)4cm，共剪取100根，加入1%次氯酸鈉溶液，消毒1min，取出用無(wú)菌水漂洗3～4次，分別均勻擺放到15套滅菌9cm培養(yǎng)皿中，置于24℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。

1.3 疑似目標(biāo)菌的觀察

保濕培養(yǎng)7d后在體視鏡下逐根觀察苜蓿草莖稈段，觀察有無(wú)典型輪生樹枝狀分生孢子梗產(chǎn)生。

1.4 目標(biāo)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用接種針沾下分生孢子梗頂端的孢子團(tuán)，在含青霉素的培養(yǎng)基上畫線分離培養(yǎng)，進(jìn)一步進(jìn)行單孢分離而獲得純培養(yǎng)。觀察單孢分離培養(yǎng)后菌落生長(zhǎng)的形態(tài)、菌絲特征，以及分生孢子梗和分生孢子，有無(wú)休眠菌絲、厚垣孢子、微菌核產(chǎn)生等情況。

1.5 目標(biāo)菌純培養(yǎng)的PCR檢測(cè)

取疑似目標(biāo)菌絲純化后液氮研磨提取DNA，取1μL為模板。試驗(yàn)采用V.albo-atrum特異性引物Vaa1： 5′-CCGGTACATCAGTCTCTTTA-3′ 和Vaa2：5′-CTCCGATGCGAGCTGTAAT-3′ 進(jìn) 行PCR檢測(cè)［6］，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為330bp，引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為：premix 15μL，10μmol／L、下游引物Vaa01／Vaa2各1μL，模板DNA 1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，以滅菌超純水補(bǔ)足總體積至30μL。陽(yáng)性對(duì)照模板為菌株M1的DNA，陰性對(duì)照模板為超純水。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；進(jìn)入循環(huán)，95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，GEL RED染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 目標(biāo)菌的發(fā)現(xiàn)

在體視鏡下觀察所有100根苜蓿草莖稈段，發(fā)現(xiàn)其中3根有典型輪生樹枝狀的分生孢子梗產(chǎn)生，分生孢子梗直立，梗上每節(jié)輪生2～4個(gè)小梗，在小梗頂端產(chǎn)生分生孢子團(tuán)（圖1a）。

圖1 苜蓿黃萎病菌的形態(tài)鑒定

2.2 目標(biāo)菌形態(tài)學(xué)的觀察與測(cè)量

用接種針在苜蓿草段的分生孢子梗頂端的孢子團(tuán)沾一下，分別在含青霉素的PDA上畫線分離，約培養(yǎng)20h分生孢子即開始萌發(fā)，用接種鏟挑取萌發(fā)的單孢進(jìn)行培養(yǎng)而獲得純培養(yǎng)。對(duì)這3根苜蓿草段上分生孢子分離而獲得的純培養(yǎng)分別編號(hào)為VA1、VA2、VA3。

目標(biāo)菌在PDA上生長(zhǎng)迅速，菌絲生長(zhǎng)0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可見的菌落斑點(diǎn)。菌落邊緣規(guī)則呈圓形或近圓形，菌絲較致密，氣生菌絲較少，菌落中心乳白色奶凍狀（圖1b）。初期主要產(chǎn)生生長(zhǎng)于培養(yǎng)基下的營(yíng)養(yǎng)菌絲，4～5d后產(chǎn)生典型的氣生輪枝狀分生孢子梗，可見二次分枝，有隔、無(wú)色至淡色，梗上每節(jié)輪生2～4個(gè)小梗，小梗大小為（21～45）（～64）μm×（1.5～3.5）μm，平均大小為33.14μm×2.18μm。分生孢子橢圓形、圓筒形，無(wú)色，單孢，少數(shù)孢子1隔，大小為（2.5～12.5）（～16）μm×（2～4.5）μm，平均大小為6.88μm×3.22μm（圖1c）。培養(yǎng)7～8d后菌落中央因產(chǎn)生休眠菌絲開始變成黑褐色，休眠菌絲黑暗褐色至黑色（圖1d），直徑3～9μm，分隔規(guī)則，隔膜間膨大，胞壁增厚，呈念珠狀，有時(shí)集結(jié)成菌絲結(jié)或瘤狀菌絲體，培養(yǎng)20d不產(chǎn)生厚垣孢子和微菌核。據(jù)此，該目標(biāo)菌的形態(tài)特征基本與有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)描述的苜蓿黃萎病菌相吻合［7］。

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)分離得到的目標(biāo)菌株純培養(yǎng)用V.albo-atrum的特異性引物Vaa1／Vaa2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，3個(gè)菌株均呈PCR陽(yáng)性。

圖2 目標(biāo)菌株純培養(yǎng)PCR檢測(cè)電泳圖

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序與基因庫(kù)比對(duì)分析

測(cè)序所得333bp長(zhǎng)序列，經(jīng)GenBank（NCBI）Blast分析（表1）表明，序列和X60705、GU291258、GQ495790、GQ336791等17個(gè)菌株登記序列100%相同，與Z29510、Z29509、GQ495792等33條序列有3個(gè)堿基的差異。

表1 菌株測(cè)序所得序列與GenBank（NCBI）已有苜蓿黃萎病菌序列Blast比對(duì)表

綜上所述，鑒定該批苜蓿草帶有我國(guó)禁止進(jìn)境的檢疫性病菌——苜蓿黃萎病菌（V.albo-atrumReinke et Berthold）。這是防城港檢驗(yàn)檢疫局首次截獲該菌。

3 討論

近年來，我國(guó)從美國(guó)進(jìn)口苜蓿草呈大幅增長(zhǎng)的趨勢(shì)，2007年不足1萬(wàn)t，2009年為7.6萬(wàn)t，而2010年高達(dá)22.72萬(wàn)t。苜蓿黃萎病菌是我國(guó)重要的進(jìn)境檢疫性病菌，不僅對(duì)苜蓿草造成危害，還會(huì)對(duì)啤酒花、蛇麻草、花生和馬鈴薯等多種園藝作物及經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害［8］；該病菌可通過昆蟲、水流、風(fēng)、收割機(jī)械、花粉等近距離傳播［9－13］，通過干草、種子、塊莖及病殘?bào)w等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播［14］，因此來自苜蓿黃萎病發(fā)生區(qū)的苜蓿飼草傳帶苜蓿黃萎病的風(fēng)險(xiǎn)很高。同時(shí)我國(guó)當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)主栽品種多為感病品種，該病菌在我國(guó)的適生性強(qiáng)，特別在我國(guó)西北、東北以及華北地區(qū)的苜蓿種植區(qū)適生程度處于較高水平［15］。一旦苜蓿黃萎病傳入定殖蔓延，對(duì)苜蓿生產(chǎn)將造成毀滅性打擊。因此，各口岸必須加強(qiáng)檢疫，嚴(yán)防該病的傳入與傳播。

本試驗(yàn)培養(yǎng)的苜蓿黃萎病菌形態(tài)學(xué)上與其相似的輪枝孢屬近似種V.dahliae、V.nigrescens、V.nubilum和V.tricorpus相比，在分生孢子梗長(zhǎng)度、輪生小梗數(shù)目、小梗和分生孢子的大小之間有差別也有交疊［16－20］，但 由 于V.dahliae在 PDA 上 培 養(yǎng) 10～14d后產(chǎn)生黑色微菌核，V.nigrescens產(chǎn)生黑褐色厚垣孢子，V.nubilum亦生黑褐色厚垣孢子，V.tricorpus產(chǎn)生休眠菌絲、微菌核和厚垣孢子［21］，而苜蓿黃萎病菌只產(chǎn)生休眠菌絲不產(chǎn)生微菌核和厚垣孢子；同時(shí)本試驗(yàn)還通過設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)該菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，因而較容易將苜蓿黃萎病菌與這幾個(gè)近似種區(qū)別開來。

本試驗(yàn)采用莖稈保濕培養(yǎng)法，可直接在體視鏡下觀察到疑似目標(biāo)菌分生孢子梗和分生孢子團(tuán)，實(shí)踐中作者嘗試過直接用挑針沾取這些分生孢子團(tuán)進(jìn)行PCR檢測(cè)，效果很好。實(shí)際工作中可以將目標(biāo)菌分離純化和PCR檢測(cè)同步進(jìn)行，以便進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間。

本試驗(yàn)從樣品保濕培養(yǎng)7～9d、目標(biāo)菌分離純化4～5d、PCR檢測(cè)2～3d、直到最后結(jié)果確認(rèn)所需時(shí)間在13～17d，而目前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《苜蓿黃萎病檢疫鑒定方法》SN／T 1145—2002中保濕培養(yǎng)需20d、還有分離純化、致病性檢測(cè)等，這樣時(shí)間會(huì)拉得很長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能適應(yīng)當(dāng)今國(guó)際貿(mào)易的需求。建議國(guó)家質(zhì)檢總局盡快組織專家對(duì)該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。

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First interception ofVerticillium albo-atrumin Fangchenggang of Guangxi

Huang Shengguang， Lu Zhaoshan， Qiu Shiming， Xi Guohua， Lu Dao， Zhong Henglu
（Fangchenggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangxi538001，China）

Three strains of the fungus，namely VA1，VA2 and VA3，were isolated from a batch of alfalfa samples，which were imported from USA and incubated under moist conditions，demonstrating the characters similar toV.albo-atrum.The strains grew rapidly on the PDA，with the colony growing at 0.8-1.0mm／d.After 2-3 days，the spot colony could be seen on the PDA.In addition，the colony had a regular and rounded margin with white compact mycelium and fewer aerial mycelia.The target fungus produced typical round aerial branched conidiophores after 4-5 days，and then became dark brown to black along with production of resting hyphae at the centre of the colony after 7-8 days，and the color of the surface and most of the back of the colony changed to black 20 days later，but still could not produce micro-sclerotia and chlamydospores.The pure cultures of the target germ were detected by the specific primers Vaa1／Vaa2.As expected，a330 bp fragment was obtained by PCR amplification.The similarity between the product and corresponding sequence inV.albo-atrumwas 100%.Therefore，it was confirmed that the target germ wasV.albo-atrum.

Verticillium albo-atrum； inspection； interception at port

S 435.4

B

10.3969／j.issn.0529-1542.2012.01.040

2011-04-29

2011-05-15