趙 丹， 康業(yè)斌

（河南科技大學林學院，洛陽 471003）

洛陽牡丹新病害—柱枝孢葉斑病

趙 丹， 康業(yè)斌＊

（河南科技大學林學院，洛陽 471003）

為了明確河南省洛陽地區(qū)牡丹葉部一種新病害的病原種類，對采自田間的典型癥狀葉片進行了常規(guī)組織分離，對單孢菌株進行了形態(tài)鑒定、rDNA ITS序列分析及致病性測定。結果表明，病原菌在PDA培養(yǎng)基上菌落初期白色絨毛狀，后期紅褐色。分生孢子梗通常呈掃帚狀，有2～3個分支，末端膨大呈泡囊狀。分生孢子直棒狀，兩端鈍圓，有0～1個隔膜，大小為（38.4～86.4）μm×（4.6～5.9）μm，平均60.1μm×5.2μm。離體葉片與活體植株接種結果表明，該菌均能侵染牡丹葉片并引起與田間相同的癥狀。據此將分離物鑒定為Cylindrocladium canadense，將該病害命名為牡丹柱枝孢葉斑病。

牡丹； 葉斑?。?柱枝孢

牡丹（Paeonia suffruticosa）為我國的傳統(tǒng)名花，屬芍藥科、芍藥屬、落葉型的亞灌木，花大色艷，國色天香，深受大家的喜愛。近年來，種植面積不斷擴大，引進品種日益增加，牡丹病害危害也呈現(xiàn)上升趨勢，嚴重影響了牡丹的觀賞價值，制約了牡丹產業(yè)化發(fā)展的進程［1－3］。2008年－2010年在對洛陽地區(qū)牡丹葉部真菌病害調查過程中發(fā)現(xiàn)了一種新病害，該病初期病斑深褐色，單個圓形，水漬狀邊緣明顯，后期病斑相連逐漸擴大成不規(guī)則形（圖1），葉片正面深褐色，背面淺褐色，高濕時葉片背面產生白色菌絲。為了明確引起該病害的病原種類，對典型癥狀葉片進行了病原分離，將分離、純化的菌株進行了形態(tài)鑒定、rDNA ITS序列分析及致病性測定，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離、純化與培養(yǎng)

病害標本于2010年10月采自洛陽市中國國花園，利用組織分離法［4］進行常規(guī)分離。分離物進行單孢純化后，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上25℃下恒溫培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)特征。3～5d后顯微觀察分生孢子梗、分生孢子的形態(tài)。

1.2 致病性測定

離體葉片接種：選取12個健康的牡丹葉片，用無菌水反復洗凈后放置于培養(yǎng)皿中的濾紙上，培養(yǎng)皿底部用含無菌水的脫脂棉和濾紙保濕；將培養(yǎng)7d后的菌落，加入無菌水配制孢子懸浮液并調節(jié)濃度至2×106個／mL，用涂抹法接種到9個葉片上，另外3個葉片以無菌水作為對照；在25℃，L∥D＝12h∥12h，恒溫保濕培養(yǎng)。

活體植株接種：在牡丹植株上選取12片健康葉片，用70%乙醇擦洗后用無菌水沖洗3次，用脫脂棉球蘸取上述孢子懸浮液后置于9片葉上，以脫脂棉球蘸取無菌水置于另外3片葉上作為對照，用塑料薄膜覆蓋整株后，25℃，L∥D＝12h∥12h，恒溫保濕培養(yǎng)。

1.3 rDNA ITS序列測定

取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7d的菌絲體，用CTAB 法［5－6］提取 DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA。利用通用引物ITS1和ITS4將提取出來的DNA進行PCR擴增，設計25μL PCR反應體系，反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸105s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應結束后，4℃下保存，將擴增產物電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測并記錄擴增產物在瓊脂糖凝膠上的圖譜。然后，進行rDNA ITS區(qū)域的序列測定，將所得序列整合后在GenBank上進行BLAST比對。

圖1 柱枝孢葉斑病田間癥狀

2 結果與分析

2.1 分離物的形態(tài)學特征

單孢分離物在PDA培養(yǎng)基上初期菌落白色，圓形，邊緣較齊整，氣生菌絲茂盛，絨毛狀，后期菌落中央由于產生色素變?yōu)榧t褐色（圖2）。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3d后產生分生孢子梗，具分隔，分生孢子梗多作2～3次分支，呈掃帚狀，主梗頂端膨大呈泡囊狀（圖3a）；有的分生孢子梗呈掃帚狀，但無主梗（圖3b）。分生孢子無色，直棒狀，兩端鈍圓，有0～1個隔膜，大小為（38.4～86.4）μm×（4.6～5.9）μm，平均60.1μm×5.2μm（圖3c）。培養(yǎng)后期菌落產生大量紅褐色的厚垣孢子（圖3d）。

2.2 致病性

被接種的葉片均在2d后出現(xiàn)癥狀，初期形成褐色小圓斑，周圍水漬狀，后期病斑擴大，數個病斑擴展連成一個不規(guī)則形褐色病斑（圖4）。5～7d后病斑正面中央常呈灰白色，用刀片刮下鏡檢可觀察到大量分生孢子，濕度大時，葉片背面產生白色菌絲。將接種病斑再分離，重新獲得病原菌。

圖4 柱枝孢葉斑病室內接種癥狀

2.3 ITS序列分析

將所得序列整合后在GenBank進行BLAST比對，結果表明，該序列（序列號為JF418968）與在DNA序列庫中登錄號為AF348256.2和AF348244.2的Cylindrocladium canadenseITS區(qū)段DNA序列的同源性為100%。

3 結論與討論

根據分離物的形態(tài)特征、rDNA ITS序列分析及致病性測定，將引起牡丹葉部病害的病原菌鑒定為Cylindrocladium canadense，屬于柱枝孢屬真菌。將該病害命名為柱枝孢葉斑病。該病原菌與Li［7］等從山東菏澤牡丹病株上分離得到的病原菌相一致，但在洛陽為首次發(fā)現(xiàn)。國外報道，該病菌還能夠引起草莓和珊瑚鐘等植物葉斑?。?－9］。

［1］ 張宗巖.牡丹葉斑病的初步觀察及防治［J］.中國園林，1991，7（4）：53-55.

［2］ 于梅娥，徐敬杰，呂金剛，等.洛陽牡丹根部病蟲害種類及防治［J］.植物檢疫，2001（6）：377-378.

［3］ 段亞冰.牡丹葉斑病病原真菌鑒定及生物學特性研究［D］.洛陽：河南科技大學，2009.

［4］ 方中達.植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農業(yè)出版社，1998.

［5］ 樓兵干，陳吳健，林釵，等.一種新大豆豆莢炭疽病癥狀類型及其病原鑒定［J］.植物保護學報，2009，36（3）：229-233.

［6］ 趙思峰，方許陽，姜海榮，等.新疆加工番茄腐霉根腐病病原鑒定及其rDNA的ITS區(qū)段分析［J］.植物保護學報，2009，36（3）：219-224.

［7］ Li N，Zhao X L，Liu A X，et al.Brown spot disease of tree peony caused byCylindrocladium canadensein China［J］.J Gen Plant Pathol，2010，76：295-298.

［8］ Yuuri Hirooka，Seiju Ishikawa，Jun Takeuchi，et al.NewCylindrocladiumdiseases of strawberry and coral bells caused byCylindrocladium canadense［J］.J Gen Plant Pathol，2009，75：83-86.

［9］ Lombard L，Crous P W，Wingfield B D，et al.Species concepts inCalonectria（Cylindrocladium）［J］.Studies in Mycology，2010，66：1-14.

The new leaf spot of peony caused byCylindrocladium canadensein Luoyang，China

Zhao Dan， Kang Yebin
（College of Forestry，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China）

In order to determine the pathogen of a new leaf spot of peony in Luoyang，Henan，the pathogen was isolated from the leaves with typical symptoms，and the strains of the single spore were identified with morphological characters and DNA sequence analysis，and tested according to the standard Koch’s postulation methods.The results showed that on PDA，colony was white and orbicular，but gradually turned to red brown.Conidiophores had di-or trichotomic branches，the terminals of which expanded and formed a vesicle.Conidia were cylindrical，straight with rounded ends，with0－1 dissepiments，smooth and（38.4－86.4）μm×（4.6－5.9）μm，and the average was 60.1μm×5.2μm.The results of inoculation on the leaves in petri dishes and in living peony bodies showed that the strains could infect peony leaves and cause the same symptoms as in fields.Consequently，this pathogen was identified asCylindrocladium canadense.And this disease was named as theCylindrocladium canadenseleaf spot.

Paeonia suffruticosa； leaf spot；Cylindrocladium canadense

S 436.8

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2012.01.039

2011-04-11

2011-05-12

河南科技大學博士啟動基金項目（200709001215）；河南省科技廳重點科技攻關項目（102102110090）

＊ 通信作者 Tel：0379-64270236；E-mail：kangyb999＠163.com