張東京，吳 瑜，何 藹，楊 瀟，吳賢生，梁格豪，鄭展圖，李卓雅，詹希美，鄭小英

2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院本科生，廣州 510080

共生菌Wolbachia最早于1924年由Hertig和Wolbach在尖音庫蚊（Culexpipiens）的生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，后來被命名為Wolbachiapipientis，其分類地位屬于變形菌綱（Proteobacteria）的α亞群，立克次體目（Rickettsiaceae），無形體（Anaplasmataceae），沃爾巴克體屬（Wolbachia）。Wolbachia在自然界中廣泛存在，其主要宿主為節(jié)肢動(dòng)物，整個(gè)自然界估計(jì)有20%～76% 種節(jié)肢動(dòng)物受到感染。Wolbachia擁有A－H等八個(gè)菌群，在節(jié)肢動(dòng)物中感染的類型主要是A、B兩個(gè)菌群，其中A菌群可分為8個(gè)亞群，B菌群可分為4個(gè)亞群。在與宿主的長期進(jìn)化中，Wolbachia對(duì)宿主的作用主要在生殖調(diào)控方面，如誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)不親和（cytoplasmic incompatibility，CI）、誘導(dǎo)孤雌生殖（parthenogenesis－inducing，PI）、雌 性 化 （feminizing）和 殺 雄 作 用 （malekilling）等［1］。

噬菌體是一種專門寄生于細(xì)菌的一類專性病毒，Wolbachia雖然是一種胞內(nèi)菌，但是在多種昆蟲中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有噬菌體侵染該共生菌。Masui等［2］最早是在地中海粉斑螟（Ephestiakuehniella）的Wolbachia中分離出噬菌體顆粒，并命名為 WO噬菌體（phage WO）。通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)該顆粒直徑約為40 nm，具有尾狀結(jié)構(gòu)。WO噬菌體基因組約含20 kbp片段，是一種線性雙螺旋DNA。Fujii等［3］在感染有Wolbachia的蚊蟲體內(nèi)也觀察到了 WO噬菌體廣泛存在于Wolbachia的基因組中，它既可以嵌入到Wolbachia的染色體中，也可以自由地存在于細(xì)胞質(zhì)中。WO噬菌體被認(rèn)為是促進(jìn)Wolbachia基因組進(jìn)化的遺傳因子，不僅參與了Wolbachia入侵宿主的機(jī)制，還和Wolbachia兩者一起相互作用調(diào)控宿主的生殖［4］。

在自然界中，大部分白紋伊蚊（Aedesalbopictus）都感染W(wǎng)olbachiaA、B組兩個(gè)菌株系，分別為wAlb A和wAlbB［5］。在筆者前期的研究中，通過PCR方法也發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊雌蚊的各個(gè)組織部位均有wAlb A和wAlbB的雙重感染。但是各個(gè)組織部位是否也都有 WO噬菌體侵染仍不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過引物PCR的方法來檢測白紋伊蚊雌蚊的各個(gè)組織器官是否存在 WO噬菌體侵染。

在蚊蟲中，Wolbachia對(duì)宿主的影響主要是細(xì)胞質(zhì)不親和作用（CI）。CI是指精子和卵子之間的細(xì)胞質(zhì)不融合，直接結(jié)果是導(dǎo)致宿主卵不能孵化。CI在對(duì)蚊蟲的種群數(shù)量的壓制上具有非常顯著的效果［6］。目前細(xì)胞質(zhì)不親和的機(jī)制仍不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)，CI的強(qiáng)度可能與Wolbachia的密度、菌系和宿主有關(guān)，最近有學(xué)者認(rèn)為也可能與噬菌體 WO的侵染有關(guān)系［7］。因此我們通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Q－PCR）方法對(duì)白紋伊蚊雌蚊各個(gè)組織器官的Wolbachia和 WO噬菌體進(jìn)行時(shí)空定量分析，試圖在量上尋找Wolbachia、WO噬菌體和宿主三者之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示這三者之間相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蚊種及來源 白紋伊蚊廣州株實(shí)驗(yàn)種群由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室馴養(yǎng)傳代保種50代。飼養(yǎng)條件為溫度27±1℃，濕度80±5%，光照周期16 h/d，幼蟲飼以酵母片，成蚊飼以10%葡萄糖水。

1.1.2 主要試劑和儀器 試劑：動(dòng)物組織基因組提取試劑盒（艾德萊）、DNA 聚合酶（Promega）、DNA Ladder、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（東盛公司）、p MD 18－T Vector（Ta KaRa）、熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑（Thunder Bird）、其他（國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

儀器：電動(dòng)勻漿器（Kontes，美國）、電泳儀（DYY－6C，北京）、梯度PCR擴(kuò)增儀（Bio Metra，德國）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，上海）、Milli－Q型純水儀（Millipore，美國）、熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測儀（Roche 480）、超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 200c）

1.2 方法

1.2.1 白紋伊蚊雌蚊基因組DNA抽提 取剛羽化24 h以內(nèi)的白紋伊蚊（雌雄均有）于40×40×40 cm 的空籠子中飼養(yǎng)。分別于第1、5、10、15、20、30、40 d各取雌蚊5只，麻醉后于解剖鏡下解剖蚊蟲的頭部、卵巢、中腸、馬氏管、脂肪體和胸部，分別置于含有180μL裂解液的1.5 m L離心管中，利用組織研磨杵進(jìn)行勻漿后，按照艾德萊公司產(chǎn)品動(dòng)物組織基因組提取試劑盒操作說明提取蚊蟲不同組織的基因組DNA。將提取到的DNA用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行OD值測定，取OD260/OD280比值在1.7～2.1之間的樣本進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。1.2.2 PCR檢測 白紋伊蚊為wAlb A與wAlbB的雙重感染，也叫“超感染”。PCR 擴(kuò)增Wolbachiawsp基因（編碼Wolbachia的表面膜蛋白基因）和 WO噬菌體orf7基因（編碼 WO噬菌體的衣殼蛋白基因），引物序列等見表1［8，10］。PCR 反應(yīng)體系：Go Taq?Master Mix（Go Taq?DNA 聚合酶，d NTPs，MgCl2和反應(yīng)緩沖液1X溶液）10μL，引物（20μmol/L）各0.5μL，DNA模板1μL，dd H2O 8 μL。反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃60 s，55/52℃60 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。取5μL PCR產(chǎn)物于0.1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 Q－PCR檢測 采用SYBR Green熒光染料法，利用Roche LightCycler?480實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行Q－PCR檢測，觀察wAlb A、wAlbB與 WO噬菌體基因組DNA在白紋伊蚊體內(nèi)不同組織器官內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。取第1、5、10、15、20、30、40 d的白紋伊蚊雌蚊各5只，在顯微鏡下解剖其組織器官。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣1次，每個(gè)樣檢測3次，結(jié)果取3次的平均值。測定的平均值用相同時(shí)期蚊蟲內(nèi)參基因－核糖體蛋白S7（rpS7）的DNA表達(dá)平均水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到wAlb A、wAlbB與 WO噬菌體基因組DNA在白紋伊蚊不同組織的相對(duì)含量。QPCR 的引物序列見表1［8－9］。20μL的 Q－PCR 反應(yīng)體系包括：10μL 2 X SYBR qPCR MIX，上下游引物各0.5μL，1μL DNA模板和8μL水。反應(yīng)條件是：95℃3 min；95℃15 s，58/52/59℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。將wAlb A、wAlbB與 WO噬菌體三者重組質(zhì)粒用超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測定，然后用去離子水進(jìn)行10倍梯度稀釋，用作QPCR的標(biāo)準(zhǔn)品。Q－PCR結(jié)果用 LightCycler 480 software release 1.0.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果分析、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和融解曲線分析。

表1 PCR和Q－PCR檢測引物序列表Tab.1 The primer sequences of PCR and Q－PCR

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析 數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)不同組織間Wolbachia和 WO噬菌體含量進(jìn)行單因素方差分析（one－way ANOVA），對(duì)wAlbB和WO噬菌體含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析（correction anaiysis）。

2 結(jié) 果

2.1 白紋伊蚊雌蚊不同組織器官Wolbachia的感染情況 用PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的白紋伊蚊雌蚊（第5 d）進(jìn)行wAlb A與wAlbB的wsp基因擴(kuò)增，分別在的頭部、卵巢、中腸、馬氏管、脂肪體和胸部中均擴(kuò)增出501 bp和380 bp大小的片段（圖1），將PCR產(chǎn)物交華大基因公司測序，將測序片段在美國生物信息中心（NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索，證實(shí)為wAlb A和wAlbB，這說明在白紋伊蚊雌蚊的各個(gè)組織器官中均存在wAlb A與wAlbB雙重感染。

2.2 白紋伊蚊雌蚊不同組織器官 WO噬菌體的侵染情況 對(duì)白紋伊蚊雌蚊 WO噬菌體的orf7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別在的頭部、卵巢、中腸、馬氏管、脂肪體和胸部中擴(kuò)增出232 bp大小的片段（圖2），將PCR產(chǎn)物交華大基因公司測序，將測序片段NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)本序列與Gen－Bank中已注冊(cè)的 WO噬菌體orf7基因序列同源性達(dá)99%以上，可證實(shí)為 WO噬菌體，這說明在白紋伊蚊雌蚊的各個(gè)組織器官中均有 WO噬菌體的侵染。

圖1 白紋伊蚊雌蚊不同組織Wolbachia wsp基因擴(kuò)增Fig.1 The amplification of wsp gene of Wolbachia in different tissues of female Ae.albopictus1：Head；2：Ovary；3：Midgut；4：Malpighian tubules；5：Fat body；6：Thorax；M：DL 1 500 Marker

圖2 白紋伊蚊雌蚊不同組織WO噬菌體orf7基因擴(kuò)增Fig.2 The amplification of orf7 gene of phage WO in different tissues of female Ae.albopictus1：Head 2：Ovary 3：Midgut 4：Malpighian tubules 5：Fat body 6：Thorax M：DL 1 500 Marker

2.3 白紋伊蚊雌蚊不同組織器官Wolbachia和WO噬菌體的平均相對(duì)含量 將rpS7、wAlb A、wAlbB和WO噬菌體的重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Q－PCR的方法，首先測定白紋伊蚊各個(gè)組織器官在不同時(shí)期（第1、5、10、15、20、30、40 d）時(shí)內(nèi)參基因rpS7的拷貝數(shù)，并用其對(duì)不同時(shí)期的Wolbachia和WO噬菌體基因組DNA的拷貝數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)化處理，得出Wolbachia和WO噬菌體在不同組織中的時(shí)空平均相對(duì)含量。由表2可知，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，Wolbachia和WO噬菌體在蚊蟲的卵巢中的含量是最大的，其次是脂肪體、馬氏管和頭部，而中腸和胸部含量最小。Wolbachia和WO噬菌體在蚊蟲的卵巢中分布遠(yuǎn)大于其他組織器官，相比較存在著顯著性差異（P＜0.01），而其他組織之間的差異并不顯著（P＞0.05）。在卵巢中，Wolbachia和 WO噬菌體的含量如此高，反映了這兩者參與宿主的生殖調(diào)控的可能性非常大。對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，在卵巢中WO噬菌體相對(duì)含量平均相對(duì)含量大于wAlb A、wAlbB，但其間無顯著性差異（P＜0.05），而在于其它的各個(gè)組織中，wAlbB平均含量最大，WO 噬菌體決之，wAlb A最小。wAlbB和 WO噬菌體，平均含量與wAlb A間存在顯著性差異（P＜0.01）。

表2 Wolbachia和WO噬菌體在白紋伊蚊不同組織器官內(nèi)的平均相對(duì)含量Tab.2 Average relative density of Wolbachia and phage WO in different Ae.albopictus organs

2.4Wolbachia和WO噬菌體在白紋伊蚊雌蚊不同組織器官內(nèi)的定量動(dòng)態(tài)變化 將雌蚊不同時(shí)期的各個(gè)組織器官wAlb A、wAlbB和 WO噬菌體進(jìn)行Q－PCR擴(kuò)增后，得出樣品濃度，然后將樣品濃度轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)。以時(shí)間天數(shù)為X軸，以拷貝數(shù)為Y軸建立坐標(biāo)系，觀察Wolbachia和WO噬菌體在這些組織器官內(nèi)的定量動(dòng)態(tài)變化。

由圖3可得，在白紋伊蚊雌蚊的頭部、中腸、馬氏管和胸部，隨著蚊蟲生長天數(shù)的增加，wAlb A含量在逐漸下降，并且在第30 d的頭部、胸部和第40 d的中腸和馬氏管已經(jīng)檢測不到wAlb A的拷貝數(shù)，說明了這四個(gè)部位在30～40 d之間已經(jīng)沒有wAlb A感染。脂肪體中，wAlb A含量則是先逐漸升高，并在第30 d達(dá)到最大值，而后又慢慢下降。在蚊蟲的各個(gè)組織器官中，wAlb A在卵巢中的含量是最高的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他非生殖器官。隨著宿主生長天數(shù)的增加，wAlb A含量是逐漸上升，并在第20 d達(dá)到最大值。

wAlbB在頭部、卵巢、中腸和馬氏管的含量是隨著宿主生長天數(shù)的增加而逐漸下降，而在脂肪體和胸部中則是先下降后升高。由圖3可知，在卵巢中，wAlb A含量剛開始小于wAlbB，但是在第15 d之后，wAlb A含量便超過了wAlbB，但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，wAlb A的平均相對(duì)含量仍小于wAlbB的平均相對(duì)含量（wAlb A＝76.71，wAlbB＝104.23）。從圖3可看出，在各個(gè)組織器官中，噬菌體 WO的變化趨勢(shì)與wAlbB基本上是趨于一致的，隨著wAlbB含量的升高而升高，降低而降低。而跟wAlb A的變化趨勢(shì)總體上則沒有明顯的相關(guān)性，說明可能WO噬菌體侵染的主要對(duì)象是wAlbB，而不是wAlb A。

圖3 Wolbachia和WO噬菌體在白紋伊蚊雌蚊不同組織器官內(nèi)的定量動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Kinetics of Wolbachia and phage WO replication in female Ae.albopictus organs

2.5 白紋伊蚊雌蚊體內(nèi)wAlbB與WO噬菌體的相關(guān)性 為了確定wAlbB與 WO噬菌體兩者之間的相關(guān)性，我們將不同時(shí)期蚊蟲卵巢、中腸和胸部體內(nèi)wAlbB與WO噬菌體這兩者的拷貝數(shù)進(jìn)行量化關(guān)系的轉(zhuǎn)化，以 WO噬菌體的拷貝數(shù)為X軸，以wAlbB拷貝數(shù)為Y軸，建立兩者之間的量化關(guān)系。由圖4可以看出在卵巢、中腸和胸部中，這兩者之間呈正相關(guān)性（n＝18，相關(guān)系數(shù)rA＝0.9550，r2A＝0.9162，P＜0.01；rB＝0.8505，r2B＝0.728，P＜0.05；rC＝0.9692，r2C＝0.343；P＜0.01）。反之，用wAlb A和WO噬菌體兩者拷貝數(shù)則建立不起量化關(guān)系（無顯示該圖）。因此我們推論 WO噬菌體在白紋伊蚊體內(nèi)的含量可能主要取決于wAlbB的含量，其遺傳物質(zhì)在宿主體內(nèi)隨著wAlbB基因組的復(fù)制而復(fù)制，也反映了 WO噬菌體主要侵染的對(duì)象可能是wAlbB。

3 討 論

對(duì)Wolbachia的研究長期以來一直都集中于宿主的生殖組織中，然而在非生殖組織中也發(fā)現(xiàn)了Wolbachia的存在。在筆者的前期研究中，也發(fā)現(xiàn)了廣州株白紋伊蚊的各個(gè)組織器官中均存在著Wolbachia的雙重感染，而對(duì)蚊蟲各個(gè)組織器官中WO噬菌體的檢測，發(fā)現(xiàn)也均是陽性，說明在蚊蟲的各個(gè)部位均有 WO噬菌體的侵染。

圖4 白紋伊蚊雌蚊體內(nèi)w AlbB與WO噬菌體拷貝數(shù)的相關(guān)性Fig.4 The correlation between w AlbB and phage WO copies in female Ae.albopictus

通過Q－PCR方法對(duì)白紋伊蚊各個(gè)組織器官定量檢測，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)試驗(yàn)周期中，Wolbachia在白紋伊蚊雌蚊的卵巢中含量是最大的，這與Zouache［10］等的研究結(jié)果是一致的。而在各個(gè)組織器官，wAlb A含量均小于wAlbB。一般來說，Wolbachia在生殖器官中的含量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他組織器官的，但是在第40 d的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，蚊蟲脂肪體的wAlbB含量（Log10Copies＝6.99）已經(jīng)超過蚊蟲卵巢wAlbB的含量（Log10Copies＝6.59），而脂肪體的wAlb A含量（Log10Copies＝4.30）則遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于卵巢脂肪體的wAlb A的含量（Log10copies＝6。372）。對(duì)于年老的蚊蟲，Wolbachia此時(shí)在非生殖腺中的含量如此之高，有可能是因?yàn)殡S著天數(shù)的增加，蚊蟲的免疫器官（脂肪體為蚊蟲重要的免疫器官）能力慢慢下降，從而導(dǎo)致共生菌大量侵入到脂肪體中，而脂肪體中wAlbB的含量明顯大于wAlb A含量，說明可能是由于wAlbB的入侵效率大于wAlb A。

在蚊蟲傳播蚊媒病的過程中，蚊蟲的卵巢、唾液腺和中腸是3個(gè)重要的器官，本實(shí)驗(yàn)室張美春博士通過白紋伊蚊胸腔注射登革病毒，發(fā)現(xiàn)唾液腺是病毒拷貝數(shù)最高的器官，在中腸，病毒也是呈不斷增加的趨勢(shì)，而在卵巢中病毒的拷貝數(shù)非常低［11］。此研究中，發(fā)現(xiàn)蚊蟲的胸部（唾液腺所在部位）和中腸中的Wolbachia和WO噬菌體的含量是所有組織器官中最小的部位，而卵巢中這兩者的相對(duì)含量是最高的。因此，Wolbachia和 WO噬菌體含量高的部位病毒的復(fù)制拷貝數(shù)低，而兩者含量低的部位登革病毒的復(fù)制拷貝數(shù)則非常高，這說明了Wolbachia可能對(duì)病毒存在著抑制作用。L.Mousson等［12］發(fā)現(xiàn)感染有Wolbachia的白紋伊蚊感染基孔肯亞病毒（CHIV）時(shí)，對(duì)比沒有感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊感染CHIV時(shí)，沒有感染W(wǎng)olbachia的蚊蟲體內(nèi)病毒拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于有感染W(wǎng)olbachia的蚊蟲。自然感染W(wǎng)olbachia的白紋伊蚊仍然是我國登革熱主要媒介，這說明，白紋伊蚊現(xiàn)有自然感染的Wolbachia的兩個(gè)菌系對(duì)登革病毒抑制方面未有明顯影響［13］。因此如果要運(yùn)用Wolbachia來抑制登革病毒在蚊蟲媒介體內(nèi)的復(fù)制，必須從其他昆蟲物種中尋找到一個(gè)可以抑制病毒在蚊蟲體內(nèi)復(fù)制的Wolbachia菌系，將該菌系通過顯微注射的方法轉(zhuǎn)移到白紋伊蚊體內(nèi)，建立有3個(gè)菌株系感染的白紋伊蚊種群。該菌系必須滿足3個(gè)條件：一是可以隨母代傳播；二是可以引起細(xì)胞質(zhì)不親和（CI）；三是必須在蚊蟲的傳播疾病的重要器官中含量達(dá)到抑制病原體的最低限度。因此對(duì)這兩個(gè)部位的Wolbachia含量的測定與監(jiān)測便顯得非常重要。

通過Q－PCR的方法測定Wolbachia和WO噬菌體在宿主體內(nèi)不同組織器官的時(shí)空定量動(dòng)態(tài)變化來分析這三者之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示這三者之間的相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中，發(fā)現(xiàn) WO噬菌體隨著wAlbB含量的改變而改變，二者的變化趨勢(shì)基本一致，如圖4所示，因此認(rèn)為 WO噬菌體主要是取決于wAlbB含量而不是wAlb A。這結(jié)果與Chauvatcharin等［14］的研究結(jié)果剛好相反，在對(duì)泰國北碧（Kanchanaburi）野外捕捉到的白紋伊蚊的檢測中，通過Q－PCR，他們認(rèn)為WO噬菌體主要是取決wAlb A含量。這可能是因?yàn)椴煌貐^(qū)的蚊蟲存在著差別而引起的，也有可能是因?yàn)榘准y伊蚊體內(nèi)的 WO噬菌體也存在著兩種類型，一種存在于wAlbB中，另一種存在于wAlb A中，而存在于wAlb A中的WO噬菌體密度較少還達(dá)不到最低的檢測密度，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來證明。

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