徐本錦，張偉松，王 新，楊保偉，席美麗，夏效東，孟江洪，李新平

2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，楊凌 712100

金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的一種重要病原菌，有些菌株能產(chǎn)生多種外毒素（腸毒素、剝脫毒素、中毒休克毒素－1和殺白細胞素等），能夠?qū)е率澄镏卸净蚋腥荆?］。近年來，隨著抗生素的廣泛使用及濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在動物源性食品中的檢測率不斷提高［2－3］，這已成為公共關(guān)注的社會問題。

已有報道［3－4］市售雞肉中攜帶“超耐藥菌”MRSA（methicillin－resistantStaphylococcusaureus），而雞肉在我國是第二大肉類消費品，雞肉食品從加工、運輸?shù)戒N售的過程中很容易被金黃色葡萄球菌污染。目前，有關(guān)陜西省市售雞肉中金黃色葡萄球菌的耐藥性、毒素基因和MRSA的資料尚不多。本研究對陜西省市售雞肉樣本中分離的122株金黃色葡萄球菌進行藥敏實驗、毒素基因檢測和MRSA流行分析，為我國雞肉食品的安全評估提供理論依據(jù)，并為臨床用藥提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基和主要試劑 LB營養(yǎng)瓊脂，MH瓊脂，購自陸橋技術(shù)責任有限公司；Taq DNA聚合酶、d NTPs、100 bp DNA marker、DL2000 DNA marker、引物，購自大連寶生物公司；瓊脂糖（Agarose）購自Sigma公司；四環(huán)素、慶大霉素、頭孢西丁、頭孢哌酮、阿米卡星、萬古霉素、苯唑西林、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素，阿莫西林/克拉維酸14種抗生素購自sigma公司；氯化鈉購自西安化學試劑廠。

1.2 菌株與標準菌株 從陜西省524份市售雞肉樣本中分離鑒定的金黃色葡萄球菌122株，由本實驗室保存；藥敏試驗所用標準菌株ATCC29213和ATCC25923由本實驗室保存。

1.3 基因組DNA的提取 用棉簽蘸取經(jīng)純化培養(yǎng)的細菌于LB瓊脂上進行活化，用棉簽將活化培養(yǎng)的細菌置于裝有500μL蒸餾水的1.5 m L離心管中，混勻。加熱煮沸20min后，13 000rpm離心10 min，取上清液，于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增及引物設(shè)計 按照Zhang［5］等的報道執(zhí)行mec A基因的引物合成和擴增條件，通過PCR擴增鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。按照王琴［6］等的報道執(zhí)行pvl基因的引物合成和擴增條件。按照Peles［7］等的報道執(zhí)行ses和tsst－1基因的引物合成和擴增條件。按照Noguchi等［8］的報道執(zhí)行剝落毒素基因（eta和etb）的引物合成和擴增條件。以上引物均由大連寶生物公司合成，引物序列及片段長度見表1。

1.5 電泳PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為1%，利用標準大小的DNA Marker，觀察電泳完成后的凝膠，并記錄PCR擴增的結(jié)果。

1.6 藥敏性檢測 參照CLSI［9］推薦的瓊脂稀釋法執(zhí)行14種抗生素的藥敏試驗。

2 結(jié) 果

2.1mec A基因和毒素基因檢測 本研究對122株金黃色葡萄球菌進行mec A基因和毒素基因檢測，結(jié)果見圖1。4.92%（6/122）的菌株攜帶有mec A基因。59.84%（73/122）的菌株攜帶有毒素基因，其中攜帶兩種以上毒素基因的檢測率為23.77%（29/122）。pvl基因的檢出率為25.41%（31/122），腸 毒 素 基 因 的 檢 出 率 為 51.64% （63/122），其中含有傳統(tǒng)腸毒素基因（sea－see）的檢測率為17.21%（21/122），僅含有新型腸毒素基因（segsej）的檢測率為34.43%（42/122），腸毒素基因中sej的檢出率最高，達37.70%（46/122），其次是seh，為13.11%（16/122），sea、seb、sec和sed基因的檢出率 分 別為 6.56% （8/122）、3.28% （4/122）、5.74%（7/122）和1.64%（2/122），所有雞肉分離菌株中均未檢測到see、seg、sei、ets和tsst－1基因。共檢測到20種毒素基因型，其中最多基因型為sej（21.31%；26/122），其次是pvl（8.20%；10/122）。

表1 PCR擴增引物Tab.1 Oligonucleotide primers used in PCR

圖1 122株金黃色葡萄球菌ets、tsst－1、pvl和ses毒素基因檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection of ets，tsst－1，pvl and ses genes from 122 S.aureus isolates

2.2 耐藥性檢測 對122株金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗，結(jié)果見表2。菌株對紅霉素的耐藥率最高（87.70%），耐藥率較高的依次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（81.97%）、四環(huán)素（67.21%）、阿米卡星（59.02%）、環(huán) 丙 沙 星 （53.28%）、苯 唑 西 林（52.46%）和阿莫西林/克拉維酸（40.16%），對氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、頭孢西丁和頭孢哌酮的耐藥率分別為32.79%、27.05%、20.49%、13.11%和2.46%，所有菌株均對萬古霉素敏感。

表2 122株雞肉樣本金黃色葡萄球菌藥敏結(jié)果Tab.2 Antimicrobial resistances among 122 S.aureus strains isolated from retail chicken

又對所有菌株的多重耐藥狀況進行了統(tǒng)計，結(jié)果見圖2。122株金黃色葡萄球菌100.00%存在耐藥，其中3.28% （4/122）的株菌對1種抗生素耐藥，8.20% （10/122 ）的株 菌 對2種 抗 生 素 耐 藥，13.11%（16/122）的株菌對3種抗生素耐藥，22.95% （28/122 ）的 株 菌 對4種 抗 生 素 耐 藥，14.75% （18/122）的 株 菌 對 5 種 抗 生 素 耐 藥，6.56%（8/122）的株菌對6種抗生素耐藥，31.15%（38/122）的株菌對7種或7種以上抗生素耐藥，共產(chǎn)生72種耐藥譜（未列出），多重耐藥（≥3種抗生素）率達88.52%（108/122）。

圖2 市售雞肉樣本中122株金黃色葡萄球菌的多重耐藥狀況Fig.2 Multidrug resistance（MDR）observation among 122 S.aureus isolates from retail chicken

3 討 論

目 前，國 內(nèi) 外 很 多 研 究 人 員［2，10－11］已 經(jīng) 對 金 黃色葡萄球菌各類毒素基因（腸毒素基因，剝脫毒素基因以及中毒休克癥毒素基因等）的流行與分布進行了報道，但其結(jié)果差異很大。本研究分離菌株攜帶毒素基因 （59.84%）與中國的報道［10］（63.00%）基本一致，而與美國［2］（84.9%）和韓國［11］（29.6%）的報道差別較大，說明不同國家和地區(qū)以及不同來源的食源性金黃色葡萄球菌，其毒素基因的流行情況存在一定的差異，但這些毒素基因攜帶率均較高，因此，應加強食品中金黃色葡萄球菌毒素基因的檢測，防止食物中毒事件的發(fā)生。

已有研究報道［1，12］食物中毒分離株攜帶較多的新型腸毒素基因，說明新型腸毒素基因的存在可能與食物中毒有關(guān)。本研究分離菌株也攜帶較多（34.43%）的新型腸毒素基因，表明陜西省雞肉存在一定的安全隱患，因此，應加強雞肉食品中新型腸毒素基因的檢測。研究表明，全球95%的金黃色葡萄球食物中毒事件由經(jīng)典腸毒素引起［13］，本研究分離菌株攜帶經(jīng)典腸毒素基因也較多（17.21%），這進一步說明市售雞肉存在一定的安全隱患，提示我們應加強雞肉中金黃色葡萄球菌的檢測，防止其腸毒素進入食物鏈。

殺 白 細 胞 素 （panton－valentine leukocidin，PVL）是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的外毒素，是重要的致病因子，能在兒童和成人患者中造成嚴重的壞死性肺炎和皮膚損害［14］。本研究分離菌株攜帶pvl基因 （25.41%）與國內(nèi)王鳳玲等［15］（29.7%）和張靜等［16］（19.30%）報道的基本一致，而與國外 Gillet等［14］（4.5%）和 Udo等［17］（9%）報道的差別較大，提示雞肉食品中pvl毒素基因的流行可能具有地域性，應加強雞肉食品中金黃色葡萄球菌pvl基因的檢測。

近年來，食源性金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出多重耐藥［2，10］的特點，尤其是食源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistantstaphylococcusanreusMRSA）的出現(xiàn)［17］，使得食源性金黃色葡萄球菌的耐藥性問題成為公共關(guān)注的熱點問題，然而，關(guān)于我國雞肉源金黃色葡萄球菌耐藥特征的報道并不多，，本研究結(jié)果顯示，雞肉源金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率最高（87.70%），其次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑（81.97%）和四環(huán)素（67.21%），這一結(jié)果與 Pu等［2］和劉冬香等［18］等報道的食源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況存在一定的差異，如劉冬香等［18］報道中國動物源性食品中金黃色葡萄球菌耐藥率依次為四環(huán)素（42.5%）、紅霉素 （41.6%）和環(huán)丙沙星（2.7%）。而Pu等［2］報道美國零售肉中的金黃色葡萄球菌耐藥率依次為四環(huán)素（67%）、紅霉素（30%）、環(huán)丙沙星（13%）和慶大霉素（3%），說明不同國家和地區(qū)以及不同來源的食源性金黃色葡萄球菌，其耐藥情況存在一定的差異，因此，應加強監(jiān)管雞肉生產(chǎn)過程中抗生素的使用，避免耐藥菌株的產(chǎn)生。

自20世紀60年代耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）被發(fā)現(xiàn)以來，MRSA的出現(xiàn)呈上升趨勢［19］，本研究共檢測到6株（4.92%）MRSA 菌株，且所有MRSA菌株不僅對多種抗生素耐藥，而且還攜帶種類和數(shù)目較多的毒素基因，現(xiàn)已有食源性MRSA感染的報道［17］，因此，應加強雞肉食品中MRSA菌株的檢測，防止其進入到食物鏈中。

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