林 玫，周凌云，王鳴柳，廖和壯，黃 君，農(nóng)志新，農(nóng)良偉，梁大斌，權(quán) 怡，方錦嵩，張茂俊

2.大興區(qū)CDC，南寧 532300；

3.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

彎曲菌是重要的食源性人獸共患病原菌，可引起動物腹瀉、流產(chǎn)，以及人類急性腸炎、格林巴利綜合征、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter’s綜合征等多種疾病，其中引起人類致病最多見的是空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌［1－2］，近年隨著國內(nèi)外學(xué)者對其研究的深入，越來越顯示出其引起的腹瀉所導(dǎo)致的日益加重的疾病負(fù)擔(dān)［3］。為了解廣西兩種彎曲菌所引起腹瀉的流行病學(xué)特點(diǎn)以及在健康人群和動物中的攜帶狀態(tài)，為該病防治提供依據(jù)，我們于2008－2010年在廣西崇左市大新縣和南寧市開展了腹瀉病人群、健康人群、重點(diǎn)人群和食品等調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果分析如下。

1 材料與方法

1.1 流行病學(xué)調(diào)查

1.1.1 腹瀉病例調(diào)查 2008年9月－2010年12月期間，在崇左市大新縣的縣人民醫(yī)院、婦幼保健院、中醫(yī)院、疾病預(yù)防控制中心門診等4所醫(yī)院、3所鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、3所個(gè)體診所以及南寧市2所醫(yī)院（廣西婦幼保健院及南寧市第一人民醫(yī)院），對就診的符合感染性腹瀉病例定義的患者進(jìn)行個(gè)案調(diào)查和采樣。共采集糞便標(biāo)本677份分別送大新縣疾病預(yù)防控制中心（以下簡稱大新縣CDC）和廣西疾病預(yù)防控制中心（以下簡稱廣西CDC）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)，大新縣CDC所檢出的陽性標(biāo)本送至廣西CDC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核和進(jìn)一步檢測。

1.1.2 健康人群調(diào)查 2008年9月－2009年3月間，在大新縣調(diào)查5歲以下健康人群共121名，按6－12月、1－2歲、2－5歲共分3個(gè)年齡組，每組分別采集了37、38、46名健康人群（半個(gè)月內(nèi)未患過腹瀉者）共121份糞便標(biāo)本，送廣西CDC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.1.3 從業(yè)人員攜帶狀況調(diào)查 2009年9月在大新縣某養(yǎng)豬場隨機(jī)采集豬飼養(yǎng)員糞便標(biāo)本11份、食品公司屠宰廠職工糞便標(biāo)本21份共32份糞便標(biāo)本，送廣西CDC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.1.4 動物攜帶情況調(diào)查 2009年9月分別在大新縣某養(yǎng)豬場、大新縣某養(yǎng)雞場、南寧市某養(yǎng)雞場、南寧市某市場售活雞攤位共隨機(jī)采集豬糞便標(biāo)本50份、雞糞便標(biāo)本105份，送廣西CDC實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.2.1 空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌分離培養(yǎng) 用棉拭子沾取糞便涂于CCDA平板，再用接種環(huán)劃線分離培養(yǎng)。42℃微需氧培養(yǎng)48 h觀察可疑菌落。初步鑒定：菌落形態(tài)為菌落灰色、扁平、濕潤、有金屬光澤，似可穎菌落，直徑1～2 mm，邊緣完整、發(fā)亮。如無可疑菌落可繼續(xù)培養(yǎng)5～6 d。挑取可疑菌落，轉(zhuǎn)劃哥倫比亞血平板進(jìn)行分純，對血平板上的菌落，一是直接進(jìn)行PCR檢測；二是進(jìn)行革蘭染色鏡檢，如為革蘭氏陰性菌，螺旋形，彎曲桿狀，呈S形、海鷗狀或逗點(diǎn)狀，則接種API生化試劑條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。研究中使用的陽性對照菌株—空腸、結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所惠贈；以鼠傷寒沙門菌作為陰性對照菌株。1.2.2 PCR和脈沖場凝膠電泳分型

1.2.2.1 單管二重PCR鑒定空、結(jié)腸彎曲菌 空腸彎曲菌引物序列：jun1 5′－CATCTTCCCTAGTCAAGCCT－3′，jun2 5′－AAGATATGGCACTAGCAAGAC－3′；結(jié)腸彎曲菌引物序列：Col1 5′－AGGCAAGGGAGCCTTTAATC－3′，Col2 5′－TATCCTATCTACAAATTCGC－3′。取滅菌超純水制備200μL菌懸液，將其置于干式恒溫器上100℃加熱10 min，然后于12 000 r/min離心10 min，取上清液分裝Eppendorf管，作為擴(kuò)增反應(yīng)的DNA粗制模板。反應(yīng)總體系為25μL，體系中含d NTP Mixtures各0.4 mmol/L，10×Buffer 2.5μL，Ta KaRa Taq1.25 U，引物各10μmol/L，細(xì)菌DNA粗制模板1μL。

PCR 循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃1 min、59℃1 min、72℃1 min循環(huán)35次，72℃延伸5 min，然后取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1%瓊脂糖凝膠上電泳，用Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)照像。

1.2.2.2 脈沖場凝膠電泳分型方法按照Pulse Net China對空腸彎曲菌進(jìn)行PFGE分子分型的快速標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)程操作。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel表格進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，用Epi info軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 檢出的菌株及陽性率 從采集的985份檢材中共培養(yǎng)分離到21株彎曲菌。經(jīng)對以上菌株用空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得空腸彎曲菌11株、結(jié)腸彎曲菌10株。彎曲菌總的檢出率為2.13%，其中空彎和結(jié)彎檢出陽性率分別為1.12%和1.02%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1.000），見表1。

表1 各群組中彎曲菌檢出總表Tab.1 Campylobacter positive rate in all groups

2.2 腹瀉病例調(diào)查 對677例腹瀉病人進(jìn)行采樣調(diào)查，彎曲菌陽性率為0.89%。其中空腸彎曲菌為0.74%，結(jié)腸彎曲菌為0.15%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.219）。按年齡組分別為0～歲組1.19%、1～歲組0.66%、2～歲組0.00%、5～歲組1.56%、10～歲組0.00%、20～歲組4.08%、30～歲組0.00%、40～歲組0.00%、50～歲組0.00%、60～歲組0.00%。其中，0～歲組、1～歲組和20～歲組檢出空腸彎曲菌，陽性率分別為1.19%、0.66%和4.08%；5～歲組檢出結(jié)腸彎曲菌，陽性率為1.56%；按季節(jié)分，除冬季外，其余季節(jié)均檢出陽性彎曲菌，檢出陽性率分別為春季（3～5月）為1.16%、夏季（6～8月）為1.23%、秋季（9～11月）為0.62%，不同季節(jié)彎曲菌陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.600，P＝0.659）。其中空腸彎曲菌在春、夏、秋三個(gè)季節(jié)均有檢出，而結(jié)腸彎曲菌僅在春季檢出。

2.2 健康人群調(diào)查 對121名5歲以下兒童進(jìn)行調(diào)查和采樣，結(jié)果表明總陽性率為8.26%，其中空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌陽性率分別為3.31%和4.96%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.754）。其中，空腸彎曲菌以2歲以下檢出率為高，結(jié)腸彎曲菌則在每個(gè)年齡段均有檢出。不同年齡段彎曲菌檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2.282，P＝0.319），見表2。

表2 健康人群糞便標(biāo)本檢出結(jié)果Tab.2 Detection result of Campylobacter in healthy population＇s stool samples

2.3 從業(yè)人員攜帶調(diào)查結(jié)果 本次調(diào)查共對養(yǎng)豬場和屠宰廠職工采集32份糞便標(biāo)本，均未檢出空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌。

2.4 動物攜帶調(diào)查 對采集105份雞和50份豬糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明彎曲菌檢出陽性率為3.23%，其中空腸彎曲菌陽性率為1.29%，結(jié)腸彎曲菌陽性率1.94%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝1.000）。雞和豬的彎曲菌檢出陽性率分別為2.86%和4.00%，二者差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.142，P＝0.707），見表3。

表3 動物糞便標(biāo)本檢出結(jié)果Tab.3 The detection result of Campylobacter in animal’s stool samples

2.5 PCR結(jié)果 見圖1。

圖1 彎曲菌陽性參考株和21份菌株標(biāo)本PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果注：上圖泳道1、100bp Ladder Marker（最亮的條帶為500 bp）；泳道2－22為21株分離到的菌株；泳道23為空彎、結(jié)彎陽性對照；泳道24為陰性對照鼠傷寒沙門菌；泳道25為以水為模板的空白對照。Fig.1 PCR results of the positive reference strains of C.jejuni and 21 tested strainsLane 1：DNA Marker；Lane 2－22：tested strains；Lane 23：Positive control；Lane 24－25：Negative controls

2.6 菌株分型結(jié)果

2.6.1 PFGE圖譜 見圖2。

2.6.2 PFGE圖譜的聚類分析結(jié)果 對上述所得的PFGE圖譜，我們用Bio Numerics軟件進(jìn)行了分析。結(jié)果表明4株空腸彎曲菌經(jīng)Cluster分析后得到3個(gè)PFGE型?？漳c彎曲菌K018與K020的PFGE型完全相同，聚類相似性系數(shù)100%；空腸彎曲菌K021與中國CDC傳控所惠贈的空彎標(biāo)株700819的PFGE型完全相同，空腸彎曲菌K018、K020與空彎K014的聚類相似性系數(shù)為82.35%，見圖3。

圖2 彎曲菌分離株的PFGE圖注：上圖中泳道1、5為標(biāo)準(zhǔn)菌株 H9812，泳道2、3、4為 K014、K018，K020；泳道 6、7 為 K021、空彎標(biāo)株700819。Fig.2 PFGE result of tested strainsLane 1，5：H9812 Marker；Lane 2，3，4，6：C.jejuni K014，K018，K020，K021；Lane 7：Positive reference strains of C.jejuni

3 討 論

據(jù)美國國家食品網(wǎng)的監(jiān)測，彎曲菌是發(fā)病率最高的病原菌，是全球范圍內(nèi)胃腸炎的主要病因，其病例數(shù)已超過李斯特菌病、沙門菌病和志賀菌病，WHO已將彎曲菌腸炎列為最常見的腸道傳染病之一［4］。本研究已證實(shí)在廣西腹瀉病人中已成為重要的病原菌之一。本次彎曲菌檢出率偏低［5－6］，可能與基層醫(yī)務(wù)人員糞便的采樣質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)室人員的檢測經(jīng)驗(yàn)和檢測條件有關(guān)，結(jié)果也可能在一定程度上受本研究樣本量的影響。

圖3 彎曲菌分離株P(guān)FGE圖譜的聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of tested strains

結(jié)果顯示，空腸彎曲菌在2歲以下的健康人群與腹瀉人群中檢出率均高，春夏秋季均有空彎檢出，以夏季為多，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［5－7］。本研究顯示結(jié)彎在5歲以下的健康人群各年齡段與5～10歲組的腹瀉人群中有檢出，僅在春季檢出。

彎曲菌是多種動物如禽類、牛、羊及狗的正常寄居菌，可長期向外界排菌，從而引起人類感染［8］，因此，接觸和消費(fèi)禽類等動物與流行有很大的關(guān)系。結(jié)果顯示，雞中空彎菌陽性率為1.29%，結(jié)彎菌陽性率為1.94%，在豬中沒有檢出空彎菌，僅檢出結(jié)彎菌，陽性率為4%。提示我區(qū)動物中攜帶彎曲菌比較普遍，且流行呈現(xiàn)多樣化。

近年來，PCR技術(shù)空腸彎曲菌檢測中廣泛應(yīng)用［9］，本研究中，對外觀可疑的菌落，一是直接應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，二是應(yīng)用常規(guī)的生化鑒定方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，PCR技術(shù)用時(shí)3 h，常規(guī)的鑒定需要2～3 d，PCR技術(shù)可以大大的縮短鑒定時(shí)間且特異性高。提示在以后的工作中，我們可以考慮直接對糞便標(biāo)本應(yīng)用PCR技術(shù)來進(jìn)行檢測，這樣將會更加顯著的縮短檢測時(shí)間。對于空腸彎曲菌的分子分型，PFGE仍為公認(rèn)的方法［10］。PFGE檢測的是整個(gè)細(xì)菌染色體上所有酶切位點(diǎn)的變化，從整體上反映不同菌株全部基因的相關(guān)性。本研究空腸彎曲菌K018（大新縣腹瀉病人糞便標(biāo)本）與K020（南寧市腹瀉病人糞便標(biāo)本）的PFGE型完全相同，提示二者可能存在相同的感染源。

由于彎曲菌對生長條件要求苛刻，檢測周期長，對人員的經(jīng)驗(yàn)、水平要求較高，因而基層實(shí)驗(yàn)室通常不開展此項(xiàng)工作。廣西每年的腹瀉病例三十余萬例，腹瀉暴發(fā)疫情數(shù)十起，由于采樣和實(shí)驗(yàn)條件以及檢測經(jīng)驗(yàn)等的原因，其中很可能有同源空腸彎曲菌引起事件被忽視。因此要加強(qiáng)對腹瀉病人及外環(huán)境、動物等相關(guān)樣品中空腸彎曲菌的流行病學(xué)監(jiān)測。

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