董柔 封文平 曾凡星 陳宜威

1西南林業(yè)大學(xué)體育部（云南昆明650224）2北京體育大學(xué) 3國家體育總局體育科學(xué)研究所

運動對體內(nèi)水分、電解質(zhì)及其調(diào)節(jié)激素（主要有醛固酮、心鈉素、抗利尿激素）產(chǎn)生重要的影響。運動過程中伴隨大量的水分和電解質(zhì)的丟失，血漿激素水平發(fā)生改變［1，2］。 在高溫環(huán)境下運動，由于高溫和運動雙重因素的影響，機體上述變化更明顯。熱習(xí)服是提高機體在高溫環(huán)境下運動能力的有效手段。熱習(xí)服后，機體排汗能力增強，汗液中的電解質(zhì)濃度更低，身體核心溫度升高更慢，但關(guān)于體液調(diào)節(jié)激素變化的報道較少。洪長青等［3］指出單純運動應(yīng)激與單純熱應(yīng)激不能獲得運動熱應(yīng)激的適應(yīng)，只有運動應(yīng)激與熱應(yīng)激的聯(lián)合刺激才可以獲得有效的運動熱應(yīng)激適應(yīng)。所以本實驗以運動熱應(yīng)激作為熱習(xí)服的手段，經(jīng)過熱習(xí)服后再進(jìn)行高溫力竭運動，探討力竭運動后大鼠血清體液調(diào)節(jié)激素的變化以及對下丘腦AVP合成的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

SPF級成年雄性Wistar大鼠28只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2006-0009，體重 180~200 g。室溫 25℃，濕度50%，自由飲水進(jìn)食。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后，進(jìn)行坡度0、速度16m/min、時間30min的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練2次，淘汰不運動的大鼠。剩余24只大鼠隨機分為空白對照組（A組）、高溫力竭組（B組）、熱習(xí)服后高溫力竭組（C組），每組8只。動物使用許可證號：SYXK（京 2006-0017）。

1.2 實驗方案

實驗在國家體育總局體育科學(xué)研究所綜合環(huán)境運動實驗室進(jìn)行，設(shè)備為天津市森羅科技發(fā)展有限公司的CTDY-200型高溫高濕低氧訓(xùn)練系統(tǒng)?？瞻讓φ战M無任何處理，第15天直接處死取材。高溫力竭組在溫度38℃、濕度50%環(huán)境下，以速度20 m/min、坡度0進(jìn)行運動到力竭。熱習(xí)服后高溫力竭組連續(xù)在溫度38℃、濕度50%環(huán)境下以速度18 m/min、坡度0訓(xùn)練14天，第15天同高溫力竭組作相同處理。動物力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)施加機械刺激后大鼠不能繼續(xù)跑動，下跑臺后腹部觸地并呈嚴(yán)重的“甲魚狀”。

每日記錄大鼠肛溫和體重。通過測試熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠訓(xùn)練后肛溫判斷大鼠是否熱習(xí)服，根據(jù)預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練第14天，訓(xùn)練后大鼠肛溫與訓(xùn)練前無差異，說明已習(xí)服。

1.3 取材

以3%戊巴比妥鈉按0.1ml/100g體重的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，其中1 ml注入有肝素的抗凝管，靜置1~2小時后，常溫下3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘分離血漿，隨即測試血漿滲透壓；剩余血液注入玻璃試管，靜置1~2小時后，常溫下3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘分離血清，-80℃冰箱保存待測。取血后迅速斷頭，取下丘腦，用鋁箔紙包好、標(biāo)記后放入液氮急凍暫存，隨后放置于-80℃低溫冰箱保存待測。

1.4 實驗儀器和試劑

MULTISKAN MK3全自動多功能酶標(biāo)儀：美國Thermo公司；Wellwash 4 Mk 2半自動洗板機：美國Thermo公司；Model2020型滲透壓儀：美國Advanced公司；Line-gene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)：杭州博日科技有限公司；DYY-7C型電泳儀：北京六一儀器廠；DYCP-31D型水平式電泳槽：北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司；DSI-905鈉鉀氯鈣pH分析儀：中國上海。其他儀器如磁力攪拌器、恒溫振蕩器、分光光度計、培養(yǎng)箱等均為國產(chǎn)。

Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、 丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅等購自Sigma公司，AVP抗體購自Cell Signaling公司，內(nèi)參、二抗購自Santa Cruz公司，其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)。

1.5 測試指標(biāo)與方法

測試各組大鼠實驗前體重和B組、C組力竭后即刻體重。將數(shù)字體溫計插入大鼠肛門6.5 cm測得核心溫度［4］。用冰點滲透壓計測試含有離子血漿的冰點并折算為滲透壓。通過測定血清Na＋、K＋離子電極電位值，計算血清Na＋、K＋離子濃度。取-80℃冰箱保存待測血清，融化后放置至室溫，采用酶聯(lián)免疫法檢測血清抗利尿激素（ADH）、心鈉素（ANP）、醛固酮（ALD）濃度，嚴(yán)格按照Elisa試劑盒（購于RB公司）說明操作。

采用熒光定量PCR法測定大鼠下丘腦ADH mRNA表達(dá)：采用Primer premier 5及oligo 6生物軟件合成ADH基因及β-actin基因引物，其中β-actin為內(nèi)參。ADH擴增片段長度 154 bp，上游：5’-AGCCCGAGTGTCGAGAGGT -3’， 下 游 ：5’ -TAGACCCGGGGCTTGGCAGA-3’；β-actin 擴增片段 長 度 383 bp， 上 游 ：5’-CACTATTGGCAACGAGCGGTTC-3’， 下游：5’-ACTTGCGGTGCACGATGGAG-3。北京尚柏抽提試劑盒獲取下丘腦總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2min，95℃變性 20 s，58℃退火 25 s，72℃延伸 30 s，45個循環(huán)，最后 95℃延伸 20 s，反應(yīng)完畢后，行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件處理實驗結(jié)果，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），先檢驗數(shù)據(jù)方差是否齊性，若方差齊性，則采用LSD檢驗方法；若方差不齊，則采用Tamhane’s T2檢驗方法。實驗前后肛溫和體重對比采用配對樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 力竭運動時間

熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠力竭運動時間（75.20±15.39min）顯著長于高溫力竭組大鼠（27.67±4.80min），P<0.01。

2.2 體重（表1）

高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠體重較實驗前均顯著降低（P<0.01），熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠體重丟失百分比顯著高于高溫力竭組 （P<0.01）。

2.3 肛溫（表2）

高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠實驗后肛溫顯著高于實驗前（P<0.01）。

2.4 血漿滲透壓和血清激素（表3）

高溫力竭組大鼠血漿滲透壓與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠血漿滲透壓顯著高于空白對照組和高溫力竭組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組ADH濃度顯著高于空白對照組（P<0.05），同時熱習(xí)服后高溫力竭組顯著低于高溫力竭組（P<0.05）。高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組ALD濃度顯著高于空白對照組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組ANP濃度顯著低于空白對照組（P<0.05）。

表3 各組大鼠血漿滲透壓（Posm）及血清激素濃度比較

2.5 Na+、K+濃度（表4）

高溫力竭組大鼠Na+濃度高于空白對照組 （P<0.05），熱習(xí)服后高溫力竭組顯著高于空白對照組和高溫力竭組（P<0.01）。高溫力竭組和熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠Na+/K+與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表4 各組大鼠血清Na+、K+濃度比較

2.6 下丘腦ADH mRNA表達(dá)（表5）

高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達(dá)顯著高于空白對照組（P<0.01），熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達(dá)與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

表5 各組大鼠下丘腦ADH m RNA表達(dá)比較

3 討論

有報道指出，大鼠經(jīng)過高溫預(yù)處理24 h之后運動，耐力與對照組相比明顯提高，運動時間顯著延長，提示大鼠運動能力得到提高［5］。本實驗結(jié)果中，熱習(xí)服之后再進(jìn)行高溫力竭運動，大鼠運動時間明顯延長，表明熱習(xí)服能提高大鼠在熱環(huán)境下的耐疲勞能力。

機體運動時肌肉產(chǎn)熱增加，高溫環(huán)境下運動，高溫和運動兩種效應(yīng)疊加使核心溫度顯著上升［6］。多項研究［7，8］表明，體溫持續(xù)升高與高溫環(huán)境下運動能力下降相關(guān)。Hasegawa等［9］研究發(fā)現(xiàn)，運動時水分丟失是影響體溫升高的重要誘因之一。其他研究［10］表明，當(dāng)運動員丟失相當(dāng)于其體重1%的體液時，其正常生理功能就會改變。本實驗結(jié)果中，B組和C組大鼠進(jìn)行高溫力竭運動后，體溫均升高且達(dá)到極限，說明體溫升高是限制其繼續(xù)運動的重要因素。C組大鼠體重丟失明顯高于B組，C組大鼠經(jīng)過熱習(xí)服，機體能更好散熱，在散熱的同時，體液大量丟失；同時C組大鼠運動時間明顯延長，運動中大量汗液丟失，上述兩個因素導(dǎo)致C組大鼠體液大量丟失。

ADH是體內(nèi)調(diào)節(jié)水平衡的一個重要激素，具有促進(jìn)水重吸收的作用。運動中ADH的分泌主要受血漿滲透壓、循環(huán)血量變化和動脈血壓變化的調(diào)節(jié)［11-13］。運動中，機體大量出汗、脫水，血漿滲透壓增高，刺激下丘腦的滲透壓感受器，引起ADH分泌增加，血漿ADH水平升高與血漿滲透壓濃度升高成正比。高溫力竭運動后，B組和C組大鼠水分大量丟失，血漿滲透壓增高，導(dǎo)致兩組大鼠血清ADH濃度升高。雖然C組大鼠經(jīng)過熱習(xí)服，在高溫環(huán)境下運動時間較長，體重丟失比B組大鼠更明顯，血漿滲透壓升高也更明顯，但C組大鼠血漿ADH濃度低于B組?？赡苁菬崃?xí)服后機體產(chǎn)生適應(yīng)，不需要產(chǎn)生更多的ADH進(jìn)行調(diào)節(jié)，下丘腦滲透壓感受器的“調(diào)定點”發(fā)生改變。

運動可導(dǎo)致血漿 ALD 顯著增加［14，15］。 中等強度長時間運動時，醛固酮的增加幅度較短時間大強度運動時大，說明醛固酮受運動時間影響較大，醛固酮的這種變化與血漿 ANP 相反［16，17］。 錢令嘉等［18］觀測了不同熱應(yīng)激和熱習(xí)服水平的正常大鼠血漿ALD和體液Na+、K+濃度的變化，認(rèn)為血漿ALD在熱環(huán)境中調(diào)控腎臟對 Na+、K+的排泌，ALD 分泌也受 Na+、K+濃度的影響。本研究結(jié)果顯示，B組和C組大鼠血清Na+/K+均升高，但兩組之間無顯著性差異，同時兩組血清ALD濃度升高，兩組之間也無顯著性差異，說明，高溫環(huán)境下運動，ALD分泌增加，腎臟重吸收Na+增加，進(jìn)而引起水重吸收增加，維持水平衡。其他研究［19，20］也得出了相似的結(jié)論。

本實驗結(jié)果表明，高溫力竭和熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠血清ANP水平下降較明顯，可能由于ANP抑制ADH和ALD的作用。由于運動負(fù)荷和熱負(fù)荷的刺激，機體需降低ANP的抑制作用，導(dǎo)致ANP分泌降低以適應(yīng)高溫環(huán)境和運動的需要，減少Na+和水的排出，減少了對ALD和ADH釋放的抑制作用。此外，還與機體體液大量丟失，血漿容量減少導(dǎo)致心房充盈不足，對心房肌細(xì)胞的牽拉減少，使心房肌細(xì)胞釋放ANP減少有關(guān)。本實驗中，熱習(xí)服大鼠和未熱習(xí)服大鼠血清ANP濃度無差異，推測在高溫環(huán)境中運動，機體自身產(chǎn)熱及高溫?zé)彷椛鋵?dǎo)致熱量在體內(nèi)持續(xù)積累，使產(chǎn)熱率大于散熱率，體溫不斷上升并接近體溫調(diào)定點上限，機體嚴(yán)重脫水，血容量下降，心房肌分泌ANP減少。通過14天的熱習(xí)服，C組大鼠機體逐漸適應(yīng)了血漿容量減少的刺激，分泌ANP逐漸增多，同時本實驗中，血清ADH濃度降低，ADH分泌減少，不需要ANP的抵抗作用，所以ANP分泌相應(yīng)減少，最終導(dǎo)致熱習(xí)服未對血清ANP濃度產(chǎn)生明顯影響。

本研究結(jié)果表明，高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達(dá)比空白對照組高。這是由于高溫力竭運動后脫水嚴(yán)重，導(dǎo)致血容量降低，血清滲透壓濃度升高，滲透壓感受器及動脈壓力感受器發(fā)放持續(xù)信號刺激下丘腦分泌ADH。熱習(xí)服后高溫力竭組大鼠下丘腦ADH mRNA表達(dá)與高溫力竭組相比有降低趨勢，說明熱習(xí)服后再在高溫環(huán)境下運動，機體水合狀態(tài)保持較高水平，不足以動員下丘腦ADH mRNA高表達(dá)，下丘腦滲透壓感受器的“調(diào)定點”發(fā)生改變，血漿滲透壓升高未刺激下丘腦ADH mRNA表達(dá)上調(diào)。

4 小結(jié)

熱習(xí)服明顯提高大鼠在高溫環(huán)境下的運動能力。經(jīng)過熱習(xí)服后，血液中抗利尿激素濃度降低，下丘腦滲透壓感受器“調(diào)定點”上移，血漿滲透壓變化與下丘腦分泌ADH不一致。

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