楊 磊，王 瀟，孔福全，隋 麗，崔素珍，鄭潔瑩，馬南茹，趙 葵

(中國原子能科學研究院，北京 102413)

1 前言

腫瘤是一種常見多發(fā)病，對人類健康威脅很大，其中惡性腫瘤的死亡率相當高，因此，如何有效地治療腫瘤是擺在我們面前的一項重要任務。惡性腫瘤的病因和臨床表現(xiàn)非常復雜，現(xiàn)主要采用外科手術、射線輻照和中西藥物等手段進行治療。射線輻照曾經(jīng)只用光子射線，隨著電子加速器及其他技術的發(fā)展，療效雖有所改善，但其生物效應總不如高LET射線，這些射線中，以快中子治癌的研究發(fā)展速度較快。

中子是能夠釋放出直接電離粒子或引起核變化的非帶電粒子。在與組織物質作用過程中產(chǎn)生帶電粒子，有一定能量的次級帶電粒子能夠引起電離和激發(fā)，從而使機體組織受到損傷[1]。中子屬于高傳能線密度(linear energy transfer，LET)輻射，它對DNA的損傷比同劑量的 γ射線更“有效”[2]，其細胞遺傳學效應敏感。世界第一屆快中子放療基本理論與實際應用會議于1970年在荷蘭召開，至今已開過多次中子治癌國際專業(yè)會議，專家們對中子治癌的療效是肯定的[3]。1975年至1983年4月，日本對1016例癌癥患者進行了快中子治療，以前用光子射線難治的一些癌癥，如喉頭癌、班氏肺癌、骨肉瘤和惡性黑色素癌等，現(xiàn)已取得較好的療效。美國費米實驗室從1976年開始用快中子治癌的臨床研究，10年中共治療了1400名患者，對唾液腺癌和惡性黑色素癌的局部控制率比光子射線分別高1倍和2倍左右?？墒呛髞恚绹派渲委熌[瘤學組織(RTOG)對307例不能手術的頭頸部鱗癌進行快中子臨床隨機研究，結果認為，在局部控制率等指標與光子組無統(tǒng)計學意義的差別[4]。這表明快中子放療并不是對所有癌癥都有優(yōu)越性的。另外，幾個研究單位對同一癌癥患者采用快中子放療的效果不一致，原因是多方面的，它包括放療設備性能的差異、發(fā)射物理學參數(shù)條件的差異和對有關放射生物學因素掌握程度的不同等。

用快中子代替光子射線治療，物理效應基本相似，但其生物效應則優(yōu)于光子射線:如相對生物效應高，即殺滅相同細胞，快中子所需的吸收劑量比光子小;氧增比小，說明快中子對缺氧細胞殺滅能力強;另外，在細胞增殖過程中，光子對相對靜止期細胞不敏感，而快中子則無此限制[5]。本實驗以14 MeV快中子照射體外培養(yǎng)的U251(人腦膠質瘤)細胞，研究快中子輻照誘發(fā)U251細胞的相關生物效應。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗中所用細胞系為人腦膠質瘤(U251)細胞系，購自北京協(xié)和細胞中心(Cell Resource Center);MEM(Eagle’s minimum essential medium)培養(yǎng)基購自邁晨科技公司;Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司。

2.2 細胞培養(yǎng)

U251細胞在含10%胎牛血清(杭州四季青公司)、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中，置于37℃的5%CO2孵箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度。

2.3 輻照條件及中子劑量測定

用中國原子能科學研究院自行設計的高壓倍加器所產(chǎn)生的中子束照射所有細胞樣本。所用的反應為:

反應產(chǎn)生14 MeV中子。

實驗組設1、3、5、7 Gy共4個劑量點，另設置對照組，除不接受照射外，其他條件與實驗組相同。

以記錄伴隨α粒子的方法檢測中子，再算出細胞樣本的吸收劑量。

2.4 成克隆方法檢測細胞存活率

通過測量受不同輻射劑量照射后，有增殖能力的細胞的集落形成能力，即存活率隨劑量的變化所繪制出的劑量 －效應曲線，稱之為細胞存活曲線[6]。

U251細胞接受不同劑量的快中子輻照后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在培養(yǎng)基中備用。將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以適當?shù)募毎芏冉臃N于培養(yǎng)皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入1∶3醋酸/甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加適量Giemsa染色液染10～30 min，之后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，最后計算克隆形成率:

式(1)中，PE為未照射時形成的集落數(shù)除以接種的單個細胞數(shù)。

2.5 MTT方法測定細胞生長曲線

MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

U251細胞接受不同劑量的快中子輻照后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，以適當?shù)募毎芏冉臃N于96孔板中。在輻照后的24、48、72 h加入MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL的DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結晶物充分融解。選擇490 nm(570 nm)波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2.6 細胞凋亡率檢測

U251細胞接受不同劑量快中子輻照后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集所有細胞，按Annexin V－異硫氰酸熒光素(fluo－resceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)熒光染色試劑盒(北京凱基公司)操作說明染色后，進行流式細胞儀檢測。具體步驟如下:收集所有細胞后，用PBS洗滌細胞兩次，收集1至5×105個細胞;加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞;加入5 μL 的Annexin V－FITC混勻后，加入5 μL的 Propidium Iodide，混勻;室溫、避光。孵育5～15 min，并在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。

3 實驗結果和討論

3.1 細胞存活率的劑量效應曲線

U251細胞在接受不同劑量輻照后，其存活曲線分別見圖1和圖2。

隨著U251細胞吸收劑量的增加，存活率急劇下降。存活曲線可模擬為輻射劑量的指數(shù)函數(shù)，符合單擊單靶模型。與低LET射線相比，快中子的細胞生存曲線基本沒有亞致死性損傷修復的肩區(qū)，而是近似直線。

圖1 U251細胞存活曲線Fig.1 U251 cell survival curves

圖2 U251細胞存活曲線對數(shù)圖Fig.2 U251 cell survival curves logarithm figure

3.2 快中子輻射對U251細胞增殖的抑制

從細胞生長曲線的改變(見圖3)可見快中子輻射對U251細胞的增殖抑制和殺傷作用。細胞接受1 Gy，3 Gy劑量照射后48 h內(nèi)，并沒有出現(xiàn)明顯的增殖抑制。至72 h，快中子對細胞的增殖抑制作用逐漸體現(xiàn)出來，隨著細胞吸收劑量的增大，射線對細胞的殺傷作用逐漸增強，表現(xiàn)為OD值的逐漸下降。但與低劑量(1 Gy和3 Gy)輻照相比，吸收劑量為5 Gy和7 Gy時，細胞增殖能力的變化并無顯著性差異。

3.3 快中子誘發(fā)的U251細胞凋亡

圖4為U251細胞接受3 Gy劑量照射后24 h的流式細胞儀檢測結果。由圖4可見，凋亡細胞中多數(shù)已進入晚期凋亡繼發(fā)壞死的階段(第2象限)，有部分細胞處于早期凋亡階段(第4象限)，并有少量壞死細胞(第1象限)?？偟牡蛲黾毎麛?shù)為第2，第4象限細胞數(shù)目之和。

圖3 U251細胞在輻照后72 h內(nèi)的生長曲線Fig.3 U251 cell growth curve within 72 h after the irradiation

圖4 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果Fig.4 Cell apoptosis results measured by flow cytometry

U251細胞接受不同劑量快中子輻照24 h后(見圖5)，隨著細胞吸收劑量的增大，凋亡率增高，且主要為晚期繼發(fā)壞死階段的凋亡細胞。

3.4 討論

中子本身并不會引起物質電離，但它在生物體內(nèi)會因核反應而引起反沖質子或α粒子，這些都是高LET射線，因此中子也屬于高LET射線。高LET的射線對細胞的殺傷效應更大。

3.4.1 RBE 值

相對生物效應(relative biological effectiveness，RBE)指與250 kV X線相比較，在相等生物效應的基礎上，所需的250 kV X線和待測定的(如中子)射線的劑量之比。對快中子而言，RBE值不是固定不變的，影響因素很多，主要是隨著分次劑量的降低，RBE值增高。在細胞存活曲線上，若以單次照射后產(chǎn)生的細胞存活率0.01為參考點，所對應的所需中子劑量為6.6 Gy，X線為10 Gy，則RBE值=10 Gy/6.6 Gy=1.5;同樣的若以細胞存活率 0.6 為參考點，則所需的快中子與X線劑量分別為1 Gy和3 Gy，RBE值為3 Gy/1 Gy=3?？熘凶拥募毎媲€基本沒有低LET射線亞致死性損傷修復的肩區(qū)，而是近似直線。RBE值在肩區(qū)劑量范圍內(nèi)即低劑量區(qū)是最高，分次照射實際上就是肩區(qū)部分低劑量的重復照射，故小劑量照射時的RBE值較單次大劑量照射高。

圖5 輻照24 h后流式細胞術測得的U251細胞凋亡率Fig.5 U251 cell apoptosis rate measured by flow cytometry 24 h after irradiation

高沛永等[7]研究核爆炸瞬時輻射誘發(fā)人血染色體畸變的劑量效應特點，并與60Co γ線進行比較。結果表明:中子誘發(fā)畸變的RBE一般大于3，且隨著受照劑量的降低有增高的現(xiàn)象。

據(jù)現(xiàn)代放射生物學的觀點，按增值的速度和照射后損傷表達的潛伏期長短，可把正常組織區(qū)分為早期或急性反應組織和后期反應組織，它們的RBE也不同。在低LET射線的照射后的細胞存活曲線中，后期反應組織肩區(qū)較早期反應組織肩區(qū)更彎曲。雖然RBE值均隨分次劑量降低而增加，但增加的速度在后期反應組織中更快，以致形成在高劑量區(qū)其RBE值較早期反應低，在低劑量區(qū)域即臨床相關劑量區(qū)域較早期反應組織高[8]。

3.4.2 對細胞輻射敏感性的影響

在低LET射線照射時，不同的組織和腫瘤細胞的輻射敏感性有很大差別，表現(xiàn)在細胞存活率的斜率不一樣即D0值有較大的差異，但在應用快中子等高LET射線治療時，其輻射敏感性差異顯著縮小。

針對農(nóng)村初中古詩詞教育輕視誦讀教學、照搬參考書、忽視激發(fā)學生興趣、教學手段單一等問題，依據(jù)“教師為主導、學生為主體”的理念，通過課內(nèi)進行情境教學改革，課外進行初中語文古詩詞讀書分享學習模式探索以及“網(wǎng)絡多媒體+古詩詞”的學習方式研究，形成“課內(nèi)+課外+網(wǎng)絡多媒體”三位一體相結合的教學模式。提高了學生對詩人情感的理解能力，培養(yǎng)了學生的古詩詞鑒賞能力，提高了學生的人文素養(yǎng)和審美情趣，引導學生認識中華文化的豐厚博大，吸收民族文化智慧，激發(fā)學生的想象力和創(chuàng)作潛能，促進個性發(fā)展，豐富精神世界。

3.4.3 對腫瘤的OER值的影響

幾乎所有的惡性腫瘤都是乏氧細胞，它們對射線較為抵抗。氧增強比(oxygen enhancement ratio，OER)即是在達到同樣生物效應時，乏氧細胞和富氧細胞所需的劑量之比。低LET射線單次照射的OER值在3.0左右。快中子照射時，乏氧細胞和富氧細胞的放射敏感性差異減小，OER值降為1.6左右。因而對腫瘤而言，獲得了3.0∶1.6=1.9 的治療增益。

與所有高LET射線一樣，快中子射線在體內(nèi)電離作用主要是對 DNA分子鏈的直接作用，引起DNA鏈的斷裂，而低LET射線則以間接作用為主，即通過對水的電離產(chǎn)生活躍的自由基，后者與生物大分子結合，作用于DNA鏈，該過程必須有氧的存在才能使損傷固定，這也就是低LET射線對氧的依賴作用遠大于高LET射線的原因。

3.4.4 對亞致死性損傷和潛在致死性損傷修復的影響

分次照射中亞致死性損傷和潛在致死性損傷修復是影響低LET射線照射生物效應的重要因素?，F(xiàn)在已經(jīng)證實，LET值的增加會導致?lián)p傷修復能力的減少，這也是為什么每次照射劑量變小時，快中子的RBE值會逐漸增加的原因之一。根據(jù)上述關系，可以知道只有在低LET射線照射時，腫瘤組織的修復能力大于周圍正常組織的修復能力時，那么快中子照射會得到較好的療效。

另外，當快中子照射時，由于損傷修復明顯減少甚至消失掉，其等效劑量與分次劑量的關系不像低LET射線那樣密切。換言之，分次劑量的降低不再能有效地保護后期反應組織，而同時，它帶來另一方面的意義，即適當?shù)卦龃蠓执蝿┝?，減少照射次數(shù)，縮短療程，得以克服腫瘤干細胞加速再增殖。這一點對增殖快的腫瘤尤為重要。

3.4.5 對細胞周期時相輻射敏感性差異的影響

低LET照射時，不同細胞周期的放射敏感性差異很大，最敏感的是G2/M期，最不敏感的是S期后期，通過細胞周期的重新分布，使不敏感時相細胞有機會進入敏感時相而在下一次照射中被殺滅。這已成為分割照射的生物學基礎之一。在高LET射線照射時，細胞周期時相敏感性差異明顯縮小，但由于細胞周期再分布及正常組織也存在放射敏感性的差異，因而快中子治療會帶來多大的益處尚不清楚。

因而，從上面的分析中可看到，亞致死性損傷及修復、乏氧、細胞周期等影響低LET射線生物效應的因素在高LET射線照射時的作用不那么明顯。在不同的組織之間，快中子產(chǎn)生的是一種較低LET射線簡單、均一的生物效應，RBE值的變化是由于低LET照射時生物效應的復雜性引起的[9]。

4 結語

快中子治癌是核科學技術在醫(yī)學領域的應用研究，是核粒子束流應用于腫瘤放射治療的前沿研究重要課題之一。這是涉及到放射物理學、放射化學、放射腫瘤學等學科交叉的課題。中子屬于高LET射線，具有相對生物效應高、氧增比小、一次劑量打擊殺死癌細胞較多、癌細胞積累能力及修復亞致死性損傷能力小、對細胞周期的各階段均起作用、對大多數(shù)抗輻射類型的腫瘤有效等優(yōu)點。

由快中子誘導的U251細胞劑量－存活曲線可看出，快中子對細胞殺傷較大，存活曲線可模擬為輻射劑量的指數(shù)函數(shù)，符合單擊單靶模型，且基本沒有亞致死性損傷修復的肩區(qū)。

有研究表明，U251細胞的倍增時間約為18 h。48 h內(nèi)，低劑量的快中子輻照對細胞的增殖抑制并不明顯，72 h內(nèi)抑制作用顯著，體現(xiàn)出周期阻滯作用。

細胞凋亡是細胞在病理或生理狀態(tài)下、啟動了細胞內(nèi)部的死亡程序而引起的一種主動死亡過程。細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉歸密切相關。以往的研究表明:γ射線殺死細胞的一個途徑是激活細胞的凋亡機制，本實驗的結果表明，快中子同樣可以誘發(fā)U251細胞的凋亡，且與γ射線相比，凋亡率高，表現(xiàn)出較高的相對生物學效應。

[1] 潘自強，程建平.電離輻射防護和輻射源安全[M] .北京:原子能出版社，2007.

[2] Tsoulou E，Kalfas CA，Sideris EG.Conformational properties of DNA after exposure to gamma rays and neutrons[J] .Radiation Research，2005，163(1):90 －97.

[3] 鄭秀惠.中子治癌臨床進展[J] .國外醫(yī)學腫瘤學分冊，2001，28(5):336－339.

[4] Schwartz DL，Einck J，Bellon J，et al.Fast neutron radiotherapy for soft tissue and cartilaginous sarcomas at high risk for local recurrence[J] .Int J Radiat Oncol BiolPhys，2001，50(2):449 －456.

[5] 洪忠悌.加速器在快中子治癌中的應用[J] .核物理動態(tài)，1992，9(4):27 －32.

[6] 劉樹錚，鞠桂枝，李修義，等.醫(yī)學放射生物學(修訂版)[M] .北京:原子能出版社，2006.

[7] 高沛永，劉秀林，楊 捷.核爆炸瞬時輻射誘發(fā)人血染色體畸變的劑量效應觀察[J] .遺傳，1980，2(5):6－9.

[8] 紀 剛.中子輻射的微劑量學實驗研究[J] .國外醫(yī)學－放射醫(yī)學核醫(yī)學分冊，2000，24(1):28 －31.

[9] 陳佳藝，馮 炎.現(xiàn)代快中子臨床應用的生物學機理[J] .中國腫瘤，1997，6(3):13 －14.