楊渝偉 薛冰蓉 陳小紅 俸家富

四川省綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以骨髓中克隆性漿細胞惡性增殖和異常積累為特征的腫瘤，約占血液腫瘤的10%。染色體異常在該病中有極高的發(fā)生率且有獨立的預(yù)后判斷價值，但是傳統(tǒng)細胞遺傳學方法檢測到染色體異常率只占初診患者的1/3左右。熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)能對間期細胞進行分析，克服傳統(tǒng)方法的缺陷，大大提高核型異常檢出率。本研究應(yīng)用該技術(shù)檢測39例MM初診患者，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年6 月～ 2009 年9月四川省綿陽市中心醫(yī)院MM初診患者39例，其中男24例，女15例，年齡36～80歲，中位年齡61.5歲。診斷標準依據(jù)中國多發(fā)性骨髓瘤工作組發(fā)布的《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》（2008版）[1]。ISS分期Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例；DS分期Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例；免疫球蛋白類型IgG型19例，IgA型10例，輕鏈型7例，不分泌型3例。對照組15例為非血液系統(tǒng)惡性疾病患者，其中男9例，女6例，年齡26～65歲，中位年齡57.5歲。

1.2 探針

多發(fā)性骨髓瘤FISH檢測試劑盒購自北京金菩嘉生物有限公司，內(nèi)含針對1q21區(qū)帶的序列特異性探針1q21、針對13q14區(qū)帶的序列特異性探針RBl（視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤基因）和D13S319、針對14q32區(qū)帶的序列特異性探針I(yè)GH和針對17p13區(qū)帶的特異性探針p53。標記探針-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 標本的處理

選取新鮮骨髓涂片（涂片均勻、勿厚）晾干后，56℃烤片10～20 min，100%甲醇浸泡5 min，100%乙酸浸泡30 min，室溫2xSSC液洗片2次各5 min，56℃老化玻片30～60 min或室溫下過夜老化玻片。老化好的玻片先后置37℃新鮮配制的RNase A溶液和鹽酸胃酶溶液中分別孵育30 min和10 min，2xSSC溶液洗片2次各5 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脫水各2 min，晾干后加熱至56℃，進行雜交試驗。

1.4 原位雜交

在暗室按照檢測試劑盒操作說明配制探針，73℃70%甲酰胺變性6 min，置45～50℃環(huán)境中備用。老化好的玻片置73℃70%甲酰胺中變性6 min，依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中梯度脫水各3 min，晾干，置45～50℃烤片機上預(yù)熱2～5 min，將10μL變性后的探針滴加于雜交區(qū)域，加蓋蓋玻片（避免產(chǎn)生氣泡），42℃密封過夜。雜交后的玻片依次置于46℃50%（v/v）甲酰胺/2x SSC溶液和2x SSC溶液中洗滌，室溫70%乙醇浸泡3 min。晾干后，DAPI復染15 min，封片。

1.5 結(jié)果觀察

熒光顯微鏡下觀察，通過Imstar FISH軟件控制的CCD（ProgRes MFcool）攝取圖像，每例分析100～200個間期細胞核。IGH探針正常顯示2個紅色和綠色融合的黃色熒光雜交信號，出現(xiàn)分離的紅色或綠色熒光雜交信號為IGH重排；RBl、D13S319、p53和lq21探針正常均顯示2個紅色或綠色雜交信號，無或僅有1個雜交信號為該探針缺失，具有3個及以上雜交信號的則為該探針擴增。

1.6 結(jié)果判斷

以15例非血液系統(tǒng)惡性疾病患者為對照組，計算各探針陽性細胞表達率的均值（x）和標準差（SD），并以x+3SD為陽性閾值。對于MM患者，其FISH檢測的陽性細胞表達率大于閾值判定為陽性結(jié)果，小于閾值判定為陰性結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對樣本率進行x2檢驗和Spearman相關(guān)系數(shù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各探針陽性閾值的建立

對15例非血液系統(tǒng)惡性疾病患者的骨髓樣本，每例分析100～200個間期核細胞，得到各探針陽性細胞表達率，計算均值（x）和標準差（SD），以x+3SD為陽性閾值。見表1。

表1 各染色體探針雜交信號陽性閾值

2.2 39例MM患者探針異常表達分析

39例MM患者應(yīng)用5種探針的檢測情況如圖1，A-C所示。各探針異常表達情況分析結(jié)果（表2）顯示，1q21擴增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的檢出例數(shù)（率）分別為 24例（61.5%）、15例（38.5%）、18例（46.2%）、8例（20.5%）和13例（33.3%）?？偣?1例（79.5%）存在染色體異常，23例（59.0%）存在至少兩處染色體異常。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，lq21擴增與p53缺失呈顯著性正相關(guān)（r=0.359，P=0.035）；RB1和D13S319同時缺失15例，呈顯著性正相關(guān)（r=0.854，P=0.000）。

表2 39例MM患者5種探針異常表達情況分析

圖1 5種探針的檢測情況

2.3 染色體異常與分型、分期情況

染色體異常與分型、分期的情況見表3。結(jié)果顯示：除IGH重排與DS分期之間（r=0.434，P=0.007）、p53缺失與IIS分期之間（r=-0.448，P=0.006）和D13S319缺失與免疫學分型之間（r=-0.335，P=0.040）呈顯著相關(guān)性外，其余染色體異常與D-S分期、IIS分期和免疫學分型均無相關(guān)性。

3 討論

早期對MM細胞的細胞遺傳學和分子細胞遺傳學研究表明，幾乎所有的MM都存在克隆性染色體異常，且多為復雜核型異常，其中最為常見的是1、13、14和17號染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目異常。本研究選用lq21、RBl、D13S319、p53和IGH共5種特異性探針檢測異常表達率較高的1q2l擴增、13q14缺失、17p13缺失以及14q32易位。

研究結(jié)果顯示，MM患者1q21擴增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失和IGH重排的檢出率分別為61.5%、38.5%、46.2%、20.5%和33.3%，其中發(fā)生率最高的是1q21擴增，其次是D13S319缺失。79.5%患者均存在染色體異常，其中復雜核型異常占59.0%。由于常規(guī)顯帶只有約1/3的患者檢測結(jié)果為陽性[2]，因此FISH技術(shù)相比傳統(tǒng)檢測方法，明顯提高了核型異常的檢出率，并證實MM的核型異常多為復雜核型異常。

表3 染色體核型異常與分型、分期之間關(guān)系[n（%）]

1q21區(qū)域存在與MM患者緊密相關(guān)的基因簇，其中包括IL-6受體基因，MM患者在受累的IL-6基因作用下，致使IL-6受體數(shù)目基因量效性增加，促進骨髓中漿細胞增殖分泌大量β2-MG，預(yù)后差、生存期短[3]。此外，CKSlB基因亦位于lq21區(qū)域，屬于Cks/Sucl蛋白家族，能通過Skp2和p27K-依賴和非依賴機制促進MM瘤細胞的增殖，是MM預(yù)后不良因子[4-5]。研究顯示1q21擴增的發(fā)生率為61.5%，高于國外研究結(jié)果，但與國內(nèi)報道相符[6-7]，說明中國人群MM患者lq21擴增比例較高。

RB1（13q14）和D13S319（13q14.3）是檢測13q14缺失的兩個主要部位。13q14缺失在MM發(fā)病機制中起重要作用，同時也是預(yù)示生存期短的重要指標，尤其是合并血清β2-MG升高者[8-9]。結(jié)果顯示，13q14缺失的發(fā)生率為46.2%，但是13q14缺失與1q21擴增之間無相關(guān)性（r=0.309，P=0.098），與文獻報道不符，有待于進一步擴大病例數(shù)來得出更精確的結(jié)論。

p53缺失并非MM特有的異常。研究結(jié)果顯示，p53缺失在MM患者中的發(fā)生率為20.5%，在IIS分期中存在顯著性差異（x2=7.169，P=0.021），且與IIS分期呈顯著性負相關(guān)（r=-0.448，P=0.006），說明17p13缺失是疾病過程中較少的繼發(fā)事件，且多發(fā)生在III期。Spearman相關(guān)性研究顯示，p53缺失與lq21擴增呈顯著正相關(guān)（r=0.359，P=0.035），結(jié)果支持近來國外研究報道：17p13缺失與1q21擴增共同參與激活血管新生級聯(lián)反應(yīng)，使骨髓微環(huán)境中的微循環(huán)血量增加，可能是導致MM發(fā)病的重要機制[10]。

14q32易位的發(fā)生率為33.3%，略低于相關(guān)的文獻報道。14q32 易位機制較為復雜，包括 t（11；14）（q13；q32），t（4；14）（p16.3；q32.3），t（14；18）（q32.3；q21.3）等，主要涉及編碼免疫球蛋白重鏈（IGH）的重鏈基因[11]，F(xiàn)ISH結(jié)果均表現(xiàn)為兩個分離的紅/綠雜交信號。大量實驗證實存在t（11；14）患者預(yù)后稍好，伴有t（4；14）的患者預(yù)后較差。IGH探針雖然能夠發(fā)現(xiàn)14q32易位，卻不能表明與哪條染色體進行了易位重排，其預(yù)后價值有待進一步證實。對MM分期研究結(jié)果顯示，IGH重排在疾病分期中有顯著性差異，且與D-S分期呈顯著性正相關(guān)（r=0.434，P=0.007）。在所研究的5種染色體探針中，D-S分期I期的MM患者有3/7例僅表達出IGH重排異常。這些結(jié)果均說明IGH重排是MM染色體異常的一個早期事件。

綜合上述，lq21擴增、13q14缺失、p53缺失及IGH重排是MM常見的核型異常，前三者是MM發(fā)展及預(yù)后的不良因素。FISH技術(shù)是檢測分子遺傳學異常高度敏感的方法，應(yīng)當作為評估MM常規(guī)檢查。

[1]中國多發(fā)性骨髓瘤研究組.中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南[J].中華內(nèi)科雜志，2008，47（10）：869-872.

[2]羅紹凱，蘇暢，王曉桃，等.102例多發(fā)性骨髓瘤臨床資料分析[J].臨床血液學雜志，2008，21（3）：115-116.

[3]Shaughnessy J，Zhan F，Burington B，et a1.A validated gene expression model of hIGH-risk multiple myeloma is defined by disregulated expression of genes mapping chromosome 1[J].Blood，2007，109（6）：2276-2284.

[4]Zhan F，Colla S，Wu X，et a1.CKSlB，overexpressed in aggressive disease，regulates multiple myeloma growth and survival through SKP2-and p27Kipl-dependent andindependent mechanisms[J].Blood，2007，109（11）：4995-5001.

[5]Shaughnessy J.Amplification and overexpression of CKS1B at chromosome band lq21 is associated with reduced levels of p27 and an aggressive clinical course in multiple myeloma[J].Hematology，2005，10（suppl 1）：117-126.

[6]Chng WJ，Van Wier SA，Ahmann GJ，et al. A validated FISH trisomy index demonstrates the hyperdiploid and nonhyperdiploid dichotomy in MGUS[J].Blood，2005，106（6）：2156-2161.

[7]楊瑞芳，李春溟，陳麗娟，等.熒光原位雜交技術(shù)檢測MM分子遺傳學改變及其意義[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志，2010，27（5）：567-570.

[8]Saughnessy J，Tian E，Sawyer J，et a1.High incidence of chromosome 13 deletion in multiple myeloma detected by multiprobe interphase FISH[J].Blood，2000，96（4）：1505．

[9]Facon T，Aver-Leiseau H，Guillerm G，et a1.Chromosome 13 abnormaliies identified by FISH analysis and serum β2-microglobulin produce a powerful myeloma staging system for patients receiving hIGH-dose therapy[J].Blood，2001，97（6）：1561-1577.

[10]Jens H，Christian MZ，Andreas N，et a1.Gain of lq21 and distinct adverse cytogenetic abnormalities correlate with increased microcirculation in multiple myeloma[J].Int J Cancer，2008，122（12）：2871-2875.

[11]王志敏，叢雅琴，馬立寧，等.Cyr61和VEGF在慢性髓細胞白血病中的表達及相關(guān)性探討[J].臨床血液學雜志，2009，22（7）：354-356.