董秋月，陳檬燕，辛楊，秦雪艷，程卓，石陸娥

（杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

隨著生活水平的提高，大家開(kāi)始更多地關(guān)注健康，人們對(duì)食品的要求也不再僅限于滿足最基本的生理需求。于是，像益生菌、益生元這類(lèi)有益于身體健康的食品添加劑逐漸吸引了人們的眼球。雖然目前益生菌的多種益生性能已經(jīng)被大家所認(rèn)可，但是益生菌制品卻沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)。這主要是因?yàn)橐嫔谋２夭灰?，更重要的是益生菌的種類(lèi)繁多。篩選出動(dòng)物體內(nèi)的不同益生菌，研究益生菌的生理生化特性，進(jìn)行安全性鑒定是近年來(lái)微生物研究中重要的重要組成部分[1]。益生菌在促進(jìn)人體健康和防止疾病中發(fā)揮著重要的作用，是未來(lái)功能食品發(fā)展的重要領(lǐng)域。

1 益生菌的來(lái)源、種類(lèi)

益生菌來(lái)源主要是動(dòng)物腸道正常生理性菌和非腸道菌?？茖W(xué)家已發(fā)現(xiàn)的益生菌大體上分成3大類(lèi)，其中包括：（1）乳酸桿菌類(lèi)（如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌等）；（2）雙歧桿菌類(lèi)（如長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌、青春雙歧桿菌等）[2]；（3）革蘭氏陽(yáng)性球菌（如糞鏈球菌、乳球菌、中介鏈球菌等）。此外，還有一些釀酒酵母菌、布氏酵母菌、部分霉菌與非致病性大腸桿菌亦可歸入益生菌的范疇。

2 益生菌的選擇[3]

2.1 安全性要求

（1）人類(lèi)用的益生菌要來(lái)自于人體；（2）分離來(lái)自于健康人的胃腸道；（3）不能產(chǎn)生某些疾?。ㄈ缧膬?nèi)膜炎或胃腸道紊亂）；（4）沒(méi)有可傳遞的抗生素基因。

2.2 功能性要求

（1）耐膽汁；（2）耐酸和耐胃液；（3）可黏附在胃腸道等上皮表面并且能夠存活（定植和黏附力）；（4）刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫力，并不引起某些炎癥；（5）對(duì)病原菌有拮抗作用（抑菌作用），如幽門(mén)螺桿菌、沙門(mén)氏菌桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等；（6）有抗誘變和防癌功能。

2.3 加工性要求

（1）成本低廉且容易處理；（2）具有好的感官特性；（3）能夠抗噬菌體；（4）在產(chǎn)品和儲(chǔ)藏過(guò)程中能夠保持穩(wěn)定性；（5）在加工過(guò)程中能夠保證穩(wěn)定有效的活菌數(shù)。

3 益生菌的傳統(tǒng)分類(lèi)篩選方法

傳統(tǒng)的分類(lèi)鑒定方法通常指表型分類(lèi)法，包含形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)等，方法原理都是基于微生物表面受體的特異性。

形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特征試驗(yàn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察是指利用顯微鏡對(duì)被染色的微生物形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及染色特性進(jìn)行鏡下直接觀察。不同微生物在相同的培養(yǎng)基中形成的菌落特征有很大的差異，而在一定的條件下，同一種微生物的培養(yǎng)特征具有一定的穩(wěn)定性，因此可以區(qū)別不同微生物的一依據(jù)[4]。

細(xì)菌生理生化試驗(yàn)：包括含碳化合物利用、淀粉水解試驗(yàn)、糖或醇類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)、過(guò)氧化氫測(cè)定等。

4 益生菌的敏感性和存活力

采用濾紙片抑菌圈法或牛津杯法可辨別不同種類(lèi)益生菌對(duì)各種抗生素的敏感性，馬艷等[5]進(jìn)行了益生菌對(duì)抗生素的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：乳酸菌對(duì)鹽酸林可霉素、慶大霉素敏感，而對(duì)丁胺卡那霉素不敏感；芽抱桿菌對(duì)慶大霉素敏感，對(duì)鹽酸林可霉素不敏感，對(duì)丁胺卡那霉素中度敏感，視具體情況配伍使用；糞鏈球菌對(duì)慶大霉素敏感，而對(duì)鹽酸林可霉素、丁胺卡那霉素不敏感；而3種菌的復(fù)合菌可以分別與以上3種抗生素混合使用。

有研究發(fā)現(xiàn)要獲得所期望的治療效果，益生菌的數(shù)量必須達(dá)到足夠的數(shù)量。因此提高益生菌活菌數(shù)量己成為商業(yè)中的重點(diǎn)研究課題。日前，提高生菌存活力的方法有[6]：（1）選擇耐酸和耐膽鹽的菌株，有助于提高原生菌的生存能力；（2）選擇合適的接種量；（3）利用二步發(fā)酵法，可以使產(chǎn)品中的益生菌數(shù)量比原來(lái)提高4倍～5倍；（4）微膠囊技術(shù)，以此來(lái)降低細(xì)胞的損傷或死亡；（5）抗性調(diào)整，有助于提高益生菌體對(duì)不同環(huán)境的耐受性；（6）添加微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、肽和氨基酸；（7）添加抗壞血酸（作為除氧劑）；（8）選擇合適的包裝容器；（9）利用超聲波降解乳酸菌釋放a-半乳糖酶。

5 益生菌功能性的研究進(jìn)展

5.1 緩解腹瀉和調(diào)節(jié)腸道菌群的功能

根據(jù)研究表明，益生菌能夠預(yù)防和改善腹瀉，由于飲食習(xí)慣或食用抗生素均會(huì)打破腸道菌群的平衡，從而會(huì)導(dǎo)致腹瀉，補(bǔ)充益生菌能夠增加腸道蠕動(dòng)，防止細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道菌群及恢復(fù)腸道正常的pH值，從而提高腸道機(jī)能，緩解腹瀉癥狀[7]。具有改善胃腸道功能的益生菌必須具備某種特性才能在微環(huán)境中保持優(yōu)勢(shì)，如鉆附、競(jìng)爭(zhēng)排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等。以雙岐桿菌和乳酸桿菌為主的專(zhuān)性厭氧菌與黏膜上皮表面特異性受體相結(jié)合形成組分相當(dāng)同定的菌膜結(jié)構(gòu)和生物屏障，構(gòu)成腸道定植力，可有效抵御過(guò)路菌對(duì)機(jī)體的侵襲。目前已證實(shí)對(duì)胃腸炎具有預(yù)防與治療功效的專(zhuān)利菌株包括LGG，L.rhumnosus 19070-2，L.reuteri DSM 12246，Bifidobuterium Bl）-12 和 L.purucasei ST11等[8-9]。

5.2 降低血脂膽固醇水平的功能

針對(duì)益生菌降低血脂膽固醇水平的機(jī)制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了廣泛的研究，目前產(chǎn)生了多種不同的假說(shuō)，包括（1）膽鹽的脫結(jié)合；（2）膽固醇摻入細(xì)胞膜（膽固醇摻入或附著在細(xì)胞上將有可能減少膽固醇由腸道進(jìn)入血液中）；（3）益生菌對(duì)膽固醇的吸收；（4）菌體對(duì)膽固醇的吸附；（5）菌體對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)化（益生菌產(chǎn)生的膽固醇還原酶的作用將膽固醇轉(zhuǎn)化為糞烯醇排出體外從而起到了降低血液中膽固醇含最的作用）等。

目前已申報(bào)具有降低血脂脂膽固醇功能的專(zhuān)利菌株眾多，包括L.ucidophilus RP32}L.uci dophilus ATCC 4962}L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 33409 L.plunturum 299V等[10]。

5.3 調(diào)節(jié)血壓的功能

根據(jù)研究表明益生菌的降血壓作用在于其能夠代謝產(chǎn)生蛋白酶，從而降解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生ACE活性抑制肽。益生菌代謝產(chǎn)生的蛋白酶，包括肽鏈內(nèi)切酶以及氨基肽酶，在這些酶系的連續(xù)作用下，限制性水解蛋白，主要是酪蛋白，產(chǎn)生分子大小以及作用各有差異的生物活性肽段，其中包括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有抑制ACE活性的小肽，如從啤酒酵母和瑞士乳桿菌中分離的三肽物質(zhì)（Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro），具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶I活性的作用[11-12]。

此外Saivacla等[13]發(fā)現(xiàn)L.casei細(xì)胞壁成分對(duì)自發(fā)性高壓血大鼠（SHR）和和腎性高血壓大鼠（RHR）具有明顯降壓作用，這種降壓作用呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。以上研究說(shuō)明益生菌的菌體或其代謝產(chǎn)物都可能具有調(diào)節(jié)血壓的效果。

5.4 具有營(yíng)養(yǎng)功能

目前，有營(yíng)養(yǎng)特性的益生菌主要是芽孢桿菌、其次是雙歧桿菌、乳酸桿菌等[14]。益生菌（如芽孢桿菌）可產(chǎn)生多種揮發(fā)性酸，包括乙酸、丙酸、丁酸等，這些有機(jī)酸能夠降低動(dòng)物腸道的pH，抑制病原菌的生長(zhǎng)，為乳酸菌的生長(zhǎng)提供條件。也有一些益生菌如（雙歧桿菌和乳酸桿菌等）可產(chǎn)生多種機(jī)體所需要的維生素，包括 VB1，VB2，VB6，VB12以及煙酸和葉酸等，使機(jī)體保持正常的生理活動(dòng)。此外部分益生菌可代謝產(chǎn)生人體所需的必需氨基酸、短鏈脂肪酸等，均對(duì)人體骨骼成長(zhǎng)和心臟健康有重要作用。

5.5 刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫功能

益生菌對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，包括體液免疫調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用及非特異性免疫調(diào)節(jié)作用。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雙歧桿菌在胃腸道中能夠刺激B淋巴細(xì)胞活化增殖和分泌抗體，來(lái)發(fā)揮體液免疫功能。Gately等給小鼠喂短雙歧桿菌發(fā)酵乳，發(fā)現(xiàn)小鼠的腸粘膜下淋巴結(jié)增生，在機(jī)體外實(shí)驗(yàn)中，短雙歧桿菌能夠促進(jìn)小腸粘膜下淋巴結(jié)細(xì)胞增殖。經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些淋巴細(xì)胞主要是B淋巴細(xì)胞[15]。

目前人類(lèi)研究表明，益生菌對(duì)宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)具有正面作用如增強(qiáng)抵抗力。一些益生菌已被證明是使Th1/Th2的平衡傾向于Th1細(xì)胞，這可以解釋它們對(duì)過(guò)敏和抵抗力的影響，缺點(diǎn)可能是益生菌可以刺激Th1細(xì)胞介導(dǎo)的疾?。ㄈ缱陨砻庖呒膊。16]。

此外雙歧桿菌作為機(jī)體消化道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，能夠明顯激活作為機(jī)體天然抵抗力的一個(gè)重要組成部分——吞噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能。Guarino等研究發(fā)現(xiàn)，健康人口服兩雙歧桿菌，可以提高粒細(xì)胞和單核白血球的吞噬活性。

益生菌對(duì)免疫抵抗力，接種疫苗的反應(yīng)，過(guò)敏性濕疹，和潰瘍性結(jié)腸炎的影響公布的數(shù)據(jù)表明，某些益生菌可能是有效的。然而，需要更多的研究來(lái)證實(shí)這一點(diǎn)。

5.6 抗突變抗癌功能

人們發(fā)現(xiàn)，以大鼠和小鼠作為模型，一些雙歧桿菌和乳桿菌在體外具有抗癌和抗腫瘤作用[17]。

人體實(shí)驗(yàn)表明，益生菌可以通過(guò)結(jié)合、阻斷或移除來(lái)抑制致癌物和前致癌物。還可以對(duì)前致癌物轉(zhuǎn)化為致癌物的細(xì)菌及轉(zhuǎn)化酶的活力進(jìn)行抑制。說(shuō)的簡(jiǎn)單點(diǎn)，益生菌可以吸附致癌物和對(duì)致癌物質(zhì)進(jìn)行加工或轉(zhuǎn)移，減弱它們的毒性。益生菌能夠幫助身體遠(yuǎn)離有害細(xì)菌和有害的酶，它們就沒(méi)有加工致癌物的機(jī)會(huì)了。最典型的例子就是益生菌能降低糞便酶的活力，有效預(yù)防結(jié)腸癌。第二，益生菌能酸化腸道，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少有害菌的數(shù)量和改變膽汁溶解性。使膽汁減少向致癌物二次膽汁酸的轉(zhuǎn)化。第三，益生菌能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，加快對(duì)糞便中有害的致癌物的排出。

除以上生理功能外益生菌還具有其他功能，包括：①緩解不耐乳糖癥狀；②預(yù)防生殖系統(tǒng)感染；③緩解關(guān)節(jié)炎；④促進(jìn)消化作用；⑤延緩衰老（抗氧化作用）；⑥抑菌作用。

6 益生菌的潛在危害性研究

益生菌的安全性是非常重要的。通過(guò)研究益生菌在胃腸道的存活、移位、定居和代謝，可用來(lái)評(píng)價(jià)食用益生菌的正面作用和負(fù)面作用。益生菌所帶來(lái)的益處很多，但也存在著一些潛在危害，包括：①可能產(chǎn)生條件性感染（如心內(nèi)膜炎和敗血癥等局部或全身性感染）；②可能產(chǎn)生炎癥（超敏反應(yīng)）；③可能產(chǎn)生具有潛在危害性代謝產(chǎn)物和對(duì)機(jī)體有影響的代謝酶（如D型乳酸、氨基脫羧酶和硝基還原酶等）④可能會(huì)轉(zhuǎn)移抗生素基因等[18-19]。

7 分子水平上益生菌研究進(jìn)展

7.1 菌株的分離與鑒定

應(yīng)用分子生物學(xué)的方法，能夠根據(jù)益生菌基因組DNA序列的特異性，進(jìn)行群間、屬間、種間、亞種間、乃至菌株之間的鑒定，幫助從復(fù)雜的培養(yǎng)物中間分離菌株[20]。

鑒定益生菌的分了生物學(xué)方法主要包括PCR技術(shù)、基因組探針技術(shù)、基因組指紋技術(shù)（如RFLPs技術(shù)、RAPD技術(shù)和AFLPs技術(shù)））等[21]。PCR技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單快速，指利用專(zhuān)一性的引物，分析復(fù)雜菌群的菌種分布情況檢測(cè)染色體上是否存在致病因子的基因，幫助進(jìn)行菌株鑒定。探針技術(shù)與生物芯片技術(shù)結(jié)合，能夠從復(fù)雜微生物環(huán)境中快速檢出并追蹤感興趣的菌株，探針技術(shù)使用的探針包括核糖體寡核苷酸探針（一般是16S rRNA）、全染色體探針、根據(jù)基因組的特殊的序列設(shè)計(jì)的DNA片段、質(zhì)粒DNA探針等?；蚪M指紋技術(shù)利用DNA片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，能夠區(qū)分不同的菌株，幫助分析多樣的、動(dòng)態(tài)的微生物菌群[22-23]。

7.2 益生菌基因遺傳修飾

目前基因工程技術(shù)在益生菌研究方面得到了廣泛的應(yīng)用，包括：構(gòu)建能合成有用的特殊營(yíng)養(yǎng)成分的益生菌菌株、構(gòu)建能產(chǎn)生動(dòng)物生理性缺乏的物質(zhì)的益生菌株、利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗耐性菌株以及提高定植和黏附力益生菌等[24]。

呂道俊等采用PCR方法擴(kuò)增，對(duì)益生芽抱桿菌進(jìn)行遺傳改造，得到了地衣芽抱桿菌天門(mén)冬氨酸激酶基因，為研制既有益生功能，又可以在體內(nèi)直接產(chǎn)生供機(jī)體需要的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的多功能基因工程益生菌提供了基礎(chǔ)。此外利用益生菌作為體內(nèi)生物反應(yīng)器，可以表達(dá)外源基因主要包括酶基因和抗病基因，對(duì)促進(jìn)消化的外源激素、酶基因的克隆和表達(dá)的報(bào)道也比較多?？梢?jiàn)益生菌作為基因工程受體菌的應(yīng)用前景十分廣闊。

8 展望

隨著益生菌產(chǎn)品的不斷壯大，益生菌的研究工作還需要進(jìn)一步深入，亟待研究的領(lǐng)域總結(jié)如下：①通過(guò)直接對(duì)人進(jìn)行口服益生菌產(chǎn)品等試驗(yàn)，確定益生菌的生理學(xué)功能、作用機(jī)理及其產(chǎn)生的影響程度。②益生菌的功能評(píng)價(jià)，特別是對(duì)免疫系統(tǒng)、癌癥和腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)功能。③評(píng)價(jià)益生菌對(duì)腸道微生物的數(shù)量和活性的影響，基因重組技術(shù)在這一領(lǐng)域有較大的應(yīng)用潛能。④確立載體對(duì)益生菌的影響。⑤提高益生菌分類(lèi)的可靠性并使之易于分類(lèi)，提高菌株的性能和活性。

[1]Adams M R.Safety of industrial lactic and bacteria[J].J Biotechnic,1999,68:171-178

[2]Angela Botes,Svetoslav D Todorov,Johan W von Mollendorff,et al.Identification of lactic acid bacteria and yeast from boza[J].Process biochemistry,2007,42:267-270

[3]DRoy.Probiotics[J].Agricultural and Related Biotechnologies.2011,4:591-602

[4]邵虎.不同分類(lèi)鑒定方法在益生菌菌株研究中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2010(7):27-29

[5]馬艷,常志州,朱力寶.飼用益生菌對(duì)抗生索敏感性的試驗(yàn)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2002(5):50-52

[6]Shah N P.Probiotic bacteria:selective enumeration and survival in dairy foods[J].Dairy Sci,2000(83):894-907

[7]陳霞.具有益生功能的Bifidobacterium animalis subsp.lactisV9的安全性評(píng)估、生理功效及其全.基因組學(xué)研究[D].博士學(xué)位論文,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2010

[8]黃永坤,楊美芬,李海林.常見(jiàn)胃腸病患兒胃腸道菌群變化研究進(jìn)展[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007,22(7):481-484

[9]Santiago Ruiz-Moyano,Alberto Martín,María José Benito,et al.Safety and functional aspects of pre-selected lactobacilli for probiotic use in Iberian dry-fermented sausages[J].Meat science,2009,83:460-467

[10]王俊國(guó),武文博,包秋華.益生菌降膽固醇作用的研究現(xiàn)狀[J],內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011(4):32

[11]Maria Isabel T D Correia,Juliana C Liboredo,Marcella L D Consoli.The role of probiotics in gastrointe stinal surgery[J].Nutrition,2012,28:230-234

[12]徐麗丹.降血壓益生菌的篩選及安全性評(píng)價(jià)研究[D].碩士論文,黑龍江大學(xué),2010

[13]Mrda Z,Zivanovic M,Rasic J.Therapy of Helicobacter pylori infection using lactobacillus acidophilus[J].Melitsinski Pregled.1998,51:343-345

[14]Janine Ezendam,Henk van Loveren,Immune effects,safety and efficancy evaluation of probiotics[J].Toxicology Letters,2008,180:S5

[15]Jin Lee,Hyun Sun Yun,Kyu Won Cho,et al.Evaluation of probiotic characteristics of newly isolatedLactobacillusspp.:Immune modula-tion and longevity[J].International journal of food microbiology,2011,148:80-86

[16]Geoffrov M,Cvril G,Brigitte Q,et al.Use of green fluorescent protein to tag lactic acid bacterium strains underr development as live vaccine vectors[J].Applied and enviromneutal microbiology,2000,66(1):383-391

[17]何國(guó)慶,孔青,丁立孝.益生菌的功效與潛在危害[J].食品科技,2004(1):12-15

[18]舒娜,芮漢明.益生菌的作用機(jī)理、存在的問(wèn)題及其對(duì)策[J].廣州食品工業(yè)科技,2003,19(s1):67-69

[19]劉小杰,何國(guó)慶,袁長(zhǎng)貴.益生菌的安全性及其功能[J].中國(guó)乳品工業(yè),2002,30(1):17-18

[20]Franco L Vladimir,K Camilla C,et al.Specific detection of a probiotic Lactobacillus strain in faecal samples by using multiple PCR.FEMS[J].Microbiology Letters,1998,158:273-278

[21]Application molecular biological methods for studyiy prohiotic－sand the gut flora.British[J].Joumal of Nutrition,2002,88(Suppl 1):S29-S37

[22]袁鐵錚,姚斌.分子水平上益生菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2004,24(10):27-33

[23]Randazzo C L,Caggia C,Neviani E.Application of molecular approaches to study lactic acid bacteria in artisanal cheeses[J].Journal of Microbiological Methods,2009,78:1-9

[24]吳信,江寧,印遇龍,等.基因工程在益生菌中的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2007(1):152-156