毛森軍，霍健聰

（浙江海洋學(xué)院普陀科技學(xué)院，浙江 舟山 316000）

大腸桿菌是引起食物中毒的主要微生物之一，是食品微生物必檢指標(biāo)。據(jù)舟山市水產(chǎn)品加工出口協(xié)會有關(guān)數(shù)據(jù)顯示：舟山市每年出口水產(chǎn)品中由于大腸桿菌超標(biāo)而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百萬美元。目前使用防腐劑仍是解決包括大腸桿菌在內(nèi)的食品微生物超標(biāo)的主要手段之一，但因苯甲酸（鈉）等化學(xué)防腐劑食品安全性不斷受到質(zhì)疑，歐盟等國家和地區(qū)對化學(xué)防腐劑的使用和檢測越來越嚴(yán)格，開發(fā)新型食品防腐劑成為必然。天然防腐劑由于其安全性高不斷受到關(guān)注，更成為近年來的研究熱點(diǎn)。近20年來，國內(nèi)外對于天然防腐劑的研究主要集中于植物多糖、香辛料（植物源）或抗菌肽（動物源）等，但是動物源生物防腐劑普遍存在提取條件苛刻、提取成本高、抗菌譜窄、帶有異味、價(jià)格偏高等缺陷，導(dǎo)致其實(shí)際應(yīng)用極為有限[1-3]。結(jié)合我國擁有豐富的植物資源這一得天獨(dú)厚的條件，開發(fā)生物天然防腐劑成為今后防腐劑發(fā)展的主要方向。

黃芪（Astragalus mongholicus）又稱黃耆，是我國傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根[4]。《中國藥典》中記載：黃芪有益氣固表、斂汗固脫、托瘡生肌、利水消腫之功效，有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用。本研究旨在通過對黃芪提取液抑菌效果研究和抑菌特性研究，開發(fā)天然防腐劑，為黃芪開辟綜合利用新途徑。

1 材料與方法

1.1 供實(shí)菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；黃芪：購于舟山市存德堂大藥房；培養(yǎng)基制備：稱取牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g，水1000 mL，加熱融化后調(diào)節(jié)pH到7.4～7.6，分裝后在121℃條件下滅菌20 min，備用（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

1.2 黃芪提取液原液的制備

參考蔣益虹等方法，做適量改進(jìn)[5]。取適量黃芪，切碎后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)，加入20倍質(zhì)量的水，減壓后保持微沸狀態(tài)下浸提、濃縮，得到黃芪提取液原液，即1 mL提取液中含有1 g黃芪。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌液的制備

將保藏菌種的安瓿瓶用75%醫(yī)用酒精擦拭后在火焰上加熱數(shù)秒鐘，用滅菌滴灌吸取無菌去離子水滴加至安瓿瓶頸部，使其炸裂，用無菌移液管吸取0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基滴入安瓿瓶內(nèi)，振蕩將懸浮菌液注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃下培養(yǎng)24 h，作為種子菌懸液。二次活化的實(shí)驗(yàn)菌種斜面培養(yǎng)24 h后，挑取一單菌落接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以無菌水進(jìn)行梯度稀釋，同時(shí)記錄每一濃度梯度菌懸液吸光值OD，根據(jù)OD值和菌懸液濃度關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將菌懸液濃度調(diào)整為107cfu/mL左右。

1.4 抑菌效果實(shí)驗(yàn)[6]

1.4.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

將黃芪提取液用培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度，每個濃度重復(fù)2次，同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。在含有不同濃度提取液的培養(yǎng)基中加入0.1 mL菌懸液，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算，并按下式計(jì)算抑菌率。

抑菌率/%=（對照實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)-相應(yīng)濃度培養(yǎng)基菌落數(shù)）×100%/對照實(shí)驗(yàn)菌落數(shù)

1.4.2 pH對黃芪提取液抑菌活性的影響

采用0.5%NaOH和1%HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸度，設(shè)置 5、6、7、8、9 共 5 個梯度，加入低于 MIC 一個數(shù)量級濃度的提取液，再加入0.1 mL菌懸液，以無菌水作為對照，培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.4.3 溫度對黃芪提取液抑菌活性的影響

取低于MIC一個數(shù)量級濃度的黃芪提取液分別置于 60、80、100℃水浴和 121℃條件下處理 20、15、10、5 min，然后立刻取出置于冰箱中冷卻，加入0.1 mL濃度為107cfu/mL的菌懸液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h后平板計(jì)數(shù)，探討溫度對黃芪提取液抑菌活性的影響。以無菌水作用對照。

1.4.4 金屬離子對黃芪提取液抑菌活性的影響

分別選用食品中常見的NaCl和CaCl2配成0.1mol/L和0.05 mol/L培養(yǎng)基溶液，加入低于MIC一個數(shù)量級濃度的提取液，加入0.1 mL濃度為107cfu/mL的菌懸液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h后平板計(jì)數(shù)并計(jì)算抑菌率，以無菌水做對照，探討金屬離子對黃芪提取液抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芪提取液最低抑菌濃度MIC

表1 不同濃度黃芪提取液的抑菌率Table 1 Antibacterial rate of different concentration of Astragalus mongholicus

從表1可以看出，黃芪提取液對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。隨著抑菌濃度的增加，抑菌率顯著提高，其中當(dāng)提取液濃度稀釋6次后，濃度比1∶64，即提取液濃度為1.563 mg/mL時(shí)抑菌率僅為8.90%，而提取液濃度為6.25 mg/mL時(shí)抑菌率高達(dá)72.44%，高于該濃度提取液抑菌率達(dá)100%。這表明黃芪提取液最低抑菌濃度MIC為12.5 mg/mL，表明黃芪提取液在較低濃度下有較強(qiáng)的抑菌活性。

2.2 pH對黃芪提取液抑菌活性的影響

圖1是不同pH對黃芪提取液抑菌活性的影響。

圖1 不同pH對黃芪提取液抑菌活性的影響Fig.1 Effect of pH of Astragalus mongholicusn extract

從圖1中可以看出，不同pH對黃芪提取液抑菌活性影響較大，酸性條件下提取液抑菌活性較高，均達(dá)到85%以上；而中性及堿性條件下黃芪提取液抑菌活性顯著降低，pH越高則抑菌活性越低。這表明黃芪提取液在酸性條件下對大腸桿菌抑菌活性顯著高于堿性條件。這可能是由于黃芪提取液中含有多種具有抑菌活性的有機(jī)酸，因而在堿性條件下抑菌活性較弱。黃芪的有機(jī)酸主要有香草酸、阿魏酸、異阿魏酸、對羥苯基丙烯酸、咖啡酸、綠原酸及棕櫚酸[7]。黃芪抑菌主要依賴自身有機(jī)酸創(chuàng)造的酸性條件實(shí)現(xiàn)，創(chuàng)造pH低于4的環(huán)境，使得大多數(shù)致病菌難以存活。黃芪總酸度僅是抑菌作用的一方面，可能還與其他化學(xué)成分有關(guān)，如黃酮類、胡蘿卜苷（daucostero1）、葉酸（folicacid）、β-谷甾醇（β-sitostero1）等。

2.3 溫度對黃芪提取液抑菌活性的影響

溫度對黃芪提取液抑菌活性的影響見圖2。

從圖2可以看出，黃芪提取液在不同溫度條件下處理不同時(shí)間后仍就有較強(qiáng)的抑菌活性，其中提取液經(jīng)100℃和121℃處理后，抑菌率有所降低，但仍然達(dá)到85%以上；而隨著處理溫度的下降，抑菌率明顯上升，其中60℃處理抑菌率為85.76%，只比空白實(shí)驗(yàn)低8個百分點(diǎn)。這表明黃芪提取液熱較為穩(wěn)定，具有較好的熱穩(wěn)定性。這為黃芪提取液在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定了良好的理化基礎(chǔ)，可將其應(yīng)用于巴氏殺菌的食品生產(chǎn)中。

圖2 不同溫度對提取液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of temperature on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn

2.4 金屬離子對黃芪提取液抑菌活性的影響

食品中大多含有鈉離子和鈣離子，為了探討黃芪提取液能否廣泛應(yīng)用在食品中，本文研究了其提取液在氯化鈉和氯化鈣體系中的抑菌活性，見圖3。

圖3 不同金屬離子對提取液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of metal on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn extract

由圖3可知，氯化鈉和氯化鈣對提取液抑菌活性影響差異較大，其中氯化鈉在所選取的兩個濃度條件下對提取液抑菌活性基本無影響，抑菌率均在90%左右；而氯化鈣對提取液抑菌活性影響顯著，同等濃度下抑菌活性顯著小于氯化鈉，且對抑菌活性的影響隨濃度增大而增強(qiáng)，在高濃度條件下抑菌活性僅為46.23%。這可能是由于鈣離子易與多種有機(jī)酸結(jié)合形成不溶性鈣鹽，如檸檬酸鈣、酒石酸鈣等，造成環(huán)境pH上升，抑菌活性降低。

2.5 室溫下放置時(shí)間對黃芪提取液抑菌活性的影響

前人研究資料顯示：在探討天然防腐劑抑菌效果時(shí)通常目的產(chǎn)物經(jīng)制備后直接測定其抑菌活性，而不探討環(huán)境對其抑菌活性的影響。到目前為止尚未見到天然防腐劑敞露于環(huán)境狀態(tài)下對其抑菌效果影響的研究，僅有藍(lán)江林從美洲大蠊中誘導(dǎo)、分離純化抗菌肽，經(jīng)室溫下暴露放置不同時(shí)間后檢測其抑菌活性發(fā)現(xiàn)，抗菌肽抑菌活性僅能維持3 d，5 d后僅有微弱抑菌活性，而抑菌活性于6 d后完全喪失[8]。由于前人對天然防腐劑的研究多集中于蛋白肽類或多糖類，而此類天然防腐劑防腐效果從長時(shí)間看較差，時(shí)間長后反而可促進(jìn)微生物的生長，這也成為此類天然防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)的顯著弊端之一。

黃芪提取液室內(nèi)暴露與空氣中放置不同時(shí)間后抑菌效果見圖4。

圖4 放置時(shí)間對黃芪提取物液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of laytime on antibacterial activity of Astragalus mongholicusn extract

從圖4中可以看出，放置時(shí)間對提取液抑菌活性影響極大，短時(shí)間放置對抑菌活性基本無影響，表現(xiàn)在放置2 d、4 d時(shí)，抑菌活性接近90%，而隨著放置時(shí)間的延長，抑菌活性顯著降低，放置8 d時(shí)，抑菌率僅為25%，抑菌活性基本消失殆盡。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)放置8 d后提取液表面漂浮有菌落，表明提取液已被環(huán)境中的微生物污染，抑菌活性消失殆盡。這也提示黃芪提取液如要用于食品保藏，最好通過噴霧干燥等方式制成固體形式保存和應(yīng)用。

3 結(jié)論

開發(fā)安全性高、防腐效果好的天然防腐劑已經(jīng)成為今后食品防腐劑的重要發(fā)展方向。黃芪是我國特產(chǎn)之一，具有多種生理功效。從本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，黃芪提取液具有良好的抑菌活性，其最低抑菌濃度為12.5 mg/mL，在酸性條件下提取液具有較高的抑菌活性，提取液對溫度較為穩(wěn)定，適用于采用巴氏殺菌的食品當(dāng)中，黃芪提取液對鈉離子適應(yīng)性好，而鈣離子可顯著降低其抑菌活性。綜上所述，黃芪提取液對大腸桿菌具有較好的抑制效果，可作為天然食品防腐劑應(yīng)用于食品當(dāng)中，具有廣闊的開發(fā)前景。

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