許慶陵，周勇強(qiáng)，戰(zhàn)宇，顧彩琴，曾慶祝，*

（1.廣州大學(xué)分析測(cè)試中心，廣東 廣州 510006；2.廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

牡蠣，肉味鮮美，是一種高營(yíng)養(yǎng)的水產(chǎn)品，有“海中牛奶”之稱，是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，在廣東、廣西、福建、浙江、臺(tái)灣等沿海地區(qū)都進(jìn)行大量人工養(yǎng)殖，其大多數(shù)作為生鮮食品消費(fèi)，但牡蠣出水后會(huì)很快死亡，容易被微生物污染，且不耐藏，不耐凍[1]。目前，國(guó)內(nèi)牡蠣以鮮食和制成干肉制品或罐頭制品為主，少量加工成蠔油或其它調(diào)味品。隨著牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，牡蠣已出現(xiàn)供過于求和價(jià)格下跌的趨勢(shì)，開發(fā)牡蠣加工利用的新途徑對(duì)促進(jìn)牡蠣養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展具有十分重要意義[2]。

目前，針對(duì)牡蠣的研究開發(fā)熱點(diǎn)有，從牡蠣中提取抗氧化活性肽和抗腫瘤活性肽[3-4]、采用胰蛋白酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶制備牡蠣水解蛋白，但水解效果不甚理想[5]，采用Alcalase堿性蛋白酶制備牡蠣水解蛋白的研究報(bào)道相對(duì)較少。剛捕獲的魚貝類腥臭味輕微，但隨著鮮度下降，腥臭味逐漸增強(qiáng)。牡蠣肉經(jīng)過酶解制得水解蛋白之后，呈現(xiàn)出牡蠣特殊香氣和味道，主要呈味成分是酶解產(chǎn)生的氨基酸、小分子肽類，以及醛、酮、酸和酚類等[6]。同時(shí)，水解液中也有一定腥味，這種腥味給牡蠣水解蛋白的風(fēng)味帶來了負(fù)面影響，所以有必要對(duì)牡蠣水解蛋白進(jìn)行脫腥，使其具有更加純正的牡蠣風(fēng)味，其中，美拉德反應(yīng)是一種脫腥的可選方法[7-8]。針對(duì)牡蠣酶解蛋白液脫腥技術(shù)的研究起步較晚，大多是在2009年才開始研究[7]，有關(guān)研究報(bào)道也不多。為此，本實(shí)驗(yàn)采用Alcalase堿性蛋白酶道也不多。為此，本實(shí)驗(yàn)采用Alcalase堿性蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行水解制備牡蠣水解蛋白，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化其水解條件，并對(duì)牡蠣水解蛋白液的腥味脫去技術(shù)進(jìn)行研究和優(yōu)化，豐富和完善牡蠣水解蛋白的制備技術(shù)，為牡蠣肉的深加工和綜合利用提供依據(jù)，提高牡蠣的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

新鮮牡蠣：購(gòu)自超市；Alcalase堿性蛋白酶：丹麥諾維信公司；食品級(jí)活性炭：市售；葡萄糖：市售；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴振蕩器THZ-82：江蘇省金壇市宏華儀器廠；DHS-20型精密酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；紫外/可見分光光度計(jì)UV－2100：北京瑞利儀器有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀S5：德國(guó)Labor-Technik；六聯(lián)同步電動(dòng)攪拌機(jī)JJ-6：江蘇金壇市華歐儀器廠；冷凍離心機(jī)J-6M：美國(guó)BECKMAN；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Hei-VAP，德國(guó)Heidolph；微型實(shí)驗(yàn)室噴霧干燥儀YC-015：上海雅程儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣水解蛋白制備

原料解凍→搗碎→按適當(dāng)料液比加水→牡蠣原料漿液→調(diào)節(jié)酸堿度→加入蛋白酶→酶解→滅酶活→離心分離→真空濃縮。

1.3.2 測(cè)定方法

水解度（DH%）測(cè)定：甲醛滴定法[10]。

1.3.3 脫腥工藝

取一定量牡蠣水解蛋白液→加入脫腥劑（活性炭/葡萄糖）→恒溫脫腥→離心（4000 r/min，10 min）→過濾→上清液→感官評(píng)定。

1.3.4 感官評(píng)定方法

腥味感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表1及表2。

表1 活性炭脫腥評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation tandards of deodorization by activecarbon

表2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation tandards of flavor by Mailard reaction

2 結(jié)果與討論

2.1 牡蠣水解蛋白制備工藝條件

2.1.1 酶添加量的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入酶活量500×16.67 ×10-6、600 ×16.67 ×10-6、700 ×16.67 ×10-6、800 ×16.67×10-6、900 ×16.67×10-6kat/L 的 Alcalase堿性蛋白酶，于60℃水浴鍋中恒溫水解2.5 h（其間保持pH恒定），然后100℃水浴滅酶10 min，再經(jīng)5000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 酶加量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of additive mount of enzyme on the DH

圖1表明，酶加量對(duì)牡蠣水解度的影響較大，隨著酶加量從 500×16.67×10-6kat/L～900×16.67×10-6kat/L的增加，牡蠣水解度由35.9%到41.28%增大。當(dāng)酶加量增至 800×16.67×10-6kat/L（即：13.34 mkat/L）時(shí)，其水解度的增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩。從理論上不難解釋，隨著酶量的增加，酶與底物蛋白質(zhì)的接觸幾率增加，酶對(duì)底物蛋白質(zhì)的解裂作用增強(qiáng)，因此，水解度也逐漸增加。基于成本因素的考慮，選用13.34 mkat/L為適宜酶加量。

2.1.2 水解時(shí)間的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入13.34 mkat/L Alcalase堿性蛋白酶，在60℃下分別恒溫水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h（其間保持 pH 恒 1.5、2.0、2.5、3.0 h（其間保持pH恒定），然后100℃水浴滅酶10 min，再經(jīng)5000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect ofhydrolysis time on the DH

圖2表明，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，水解度逐漸增加，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到2.5 h時(shí)，水解度達(dá)到最高，隨后水解度基本保持恒定，這說明酶解時(shí)間達(dá)2.5 h時(shí)，底物蛋白質(zhì)已基本被水解，再延長(zhǎng)酶解時(shí)間，水解度也不再增加。基于經(jīng)濟(jì)效率因素，酶解時(shí)間初為2.5 h。

2.1.3 水解溫度的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別加入13.34 mkat/L Alcalase堿性蛋白酶，分別在 40、50、60、70、80 ℃下恒溫水解2.5h（其間保持pH恒定），100℃水浴滅酶10min，再經(jīng)5000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect ofhydrolysis temperature on the DH

圖3表明，在40℃～60℃時(shí)，隨著溫度的升高，水解度增加，60℃時(shí)水解度達(dá)到最高，超過60℃時(shí)水解度隨溫度的升高反而下降，這可能是由于隨著溫度的升高，Alcalase堿性蛋白酶的活性有所降低，因此水解效率降低。因此，酶解溫度初定60℃為宜。

2.1.4 酶解pH的確定

取5份牡蠣原料漿液，分別用0.05 mol/L NaOH溶液或 HCl溶液調(diào) pH 為 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分別加入13.34 mkat/L的Alcalase堿性蛋白酶，在60℃下酶解，其間分別保持各自恒定的pH，恒溫水解2.5 h，然后100℃水浴滅酶10 min，再5000 r/min下離心20 min，取上清液測(cè)水解度，結(jié)果見圖4。可知，pH對(duì)水解度的影響較大，當(dāng)pH為8.0時(shí)水解度達(dá)最大，繼續(xù)增大pH會(huì)影響酶活力，導(dǎo)致水解度反而下降。所以，酶解pH初選8.0。

2.1.5 酶解工藝條件優(yōu)化

圖2 pH對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect pH on the DH

為優(yōu)化牡蠣酶解工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選擇酶加量、溫度、時(shí)間和pH 4個(gè)因素，每個(gè)元素選3個(gè)水平，以水解度為指標(biāo)進(jìn)行酶解工藝條件優(yōu)化。因素及水平安排見表3，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。

表3 正交試驗(yàn)L9（34）因素水平表Table 3 Factor and levels of L9（34）

表4 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of hydrolysis

由正交試驗(yàn)結(jié)果表4可知，影響水解度的主次因素為A>B>D>C，即酶加量>水解時(shí)間>pH>溫度。再對(duì)獲得的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)方案為A2B2C1D2和A2B3C1D2進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A2B2C1D2方案的水解度為最高39.25%。因此，確定酶解的最優(yōu)方案為A2B3C1D2，即：酶加量13.34 mkat/L，水解時(shí)間 2.5 h，pH8.0，溫度 65℃。

2.2 水解蛋白脫腥實(shí)驗(yàn)

2.2.1 活性炭脫腥

2.2.1.1 活性炭使用量的確定

取10 mL水解蛋白液5份，按1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%比例分別加入活性炭（試驗(yàn)組號(hào)依次為A1、A2、A3、A4、A5），充分?jǐn)嚢?，?45 ℃恒溫水浴中保持80 min，再經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表5中A1～A5所示。

表5 活性炭使用條件對(duì)脫腥效果的影響Table 5 Effect of operation condition of active carbon on deodourization

由表5實(shí)驗(yàn)A1～A5可知，隨著活性炭使用添加量的增加，其顏色、澄清度及脫腥效果都是越來越好。當(dāng)活性炭添加量增至2.5%時(shí)，綜合得分及狀態(tài)與活性炭添加量增至3.0%時(shí)一樣，得分均為13分，此時(shí)，牡蠣酶解液的顏色為淡黃色，溶液澄清，腥味很小。因此，確定活性炭添加量為2.5%較為經(jīng)濟(jì)適宜。

2.2.1.2 脫腥時(shí)間的確定

取10 mL水解蛋白液5份，各加入2.5%活性炭，充分?jǐn)嚢?，?5℃水浴中下分別保持20、40、60、80、100 min（試驗(yàn)組號(hào)依次為 B1、B2、B3、B4、B5），再經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表5中B1～B5所示，可知，隨著脫腥時(shí)間的增加，牡蠣酶解液的感官評(píng)分越來越高，說明其脫腥效果越來越好。脫腥時(shí)間的達(dá)80 min時(shí)，脫腥效果已達(dá)到最佳。因此，確定80 min為宜，此條件下，牡蠣酶解液的顏色為淡黃色，溶液澄清透明，無腥味。

2.2.1.3 最適脫腥溫度的確定

取水解液5份，每份10 mL，加入2.5%活性炭，充分?jǐn)嚢瑁謩e置于 25、35、45、55、65 ℃（試驗(yàn)組號(hào)依次為 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中保持 80 min，再經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表5中C1～C5所示，可知，從25℃到45℃，感官評(píng)分隨水溫遞增，說明脫腥效果漸好。當(dāng)脫腥溫度在55℃以上時(shí)，酶解液的顏色反而加深，澄清和腥味幾乎沒有變化，因此，確定適宜脫腥溫度為45℃。

2.2.2 美拉德反應(yīng)脫腥

2.2.2.1 葡萄糖添加量的確定

取10mL水解液5份，分別加入1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%葡萄糖（試驗(yàn)組號(hào)依次為 A1、A2、A3、A4、A5），攪拌至充分混勻，在100℃水浴中保持30 min，再經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表6中A1～A5所示。

表6 美拉德反應(yīng)條件對(duì)脫腥效果的影響Table 6 Effect of condition of Maillard reaction on deodourization

由表6可知，在添加量為1.0%～3.0%時(shí)，酶解液的感官風(fēng)味總分隨添加量增加，說明其感官風(fēng)味越來越好；而當(dāng)葡萄糖添加量超過3.0%以后，酶解液的香味濃郁，沒有腥味，苦味也幾乎沒有，但是，酶解液特有的風(fēng)味有所減弱，而且鮮味受到一定抑制。因此，美拉德反應(yīng)所用還原糖（葡萄糖）的適宜添加量為3.0%。

2.2.2.2 美拉德脫腥時(shí)間的確定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分?jǐn)嚢?，?100 ℃水浴中分別保持 10、20、30、40、50 min（試驗(yàn)組號(hào)依次為 B1、B2、B3、B4、B5），再經(jīng) 4000 r/min 離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表6中B1-B5所示，可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，其感官風(fēng)味評(píng)定分?jǐn)?shù)升至最高，感覺無腥味及無苦味；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在40 min以上時(shí)，其鮮味反而因時(shí)間的延長(zhǎng)而受到抑制。因此，確定美拉德反應(yīng)還原糖（葡萄糖）的適宜反應(yīng)時(shí)間為30 min，此時(shí)，酶解液具有糖香味，無腥味，鮮味濃郁，無苦味。

2.2.2.3 美拉德反應(yīng)溫度的確定

取10 mL水解液5份，加入3.0%葡萄糖，充分?jǐn)嚢?，分別放置在 60、70、80、90、100℃（試驗(yàn)組號(hào)依次為 C1、C2、C3、C4、C5）水浴中恒溫保持 30 min，再經(jīng)4000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)過濾后按照表2的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分，評(píng)分結(jié)果見表6中C1～C5所示，可知，酶解液的感官風(fēng)味評(píng)定總分隨反應(yīng)溫度升高而遞增，說明溫度對(duì)其風(fēng)味有影響。隨著溫度的升高，美拉德反應(yīng)程度越深，產(chǎn)生的香味也越突出，在溫度為100℃下的美拉德反應(yīng)所產(chǎn)生的感官風(fēng)味達(dá)到最佳。因此，確定美拉德反應(yīng)的適宜溫度為100℃，此時(shí)，酶解液具有濃郁香味，無腥味，鮮味濃郁，且無苦味。

3 結(jié)論

1）采用Alcalase堿性蛋白酶制備牡蠣水解蛋白的最適工藝條件為：酶用量13.34 mkat/L，水解溫度65℃，pH 8.0，水解時(shí)間2.5 h，在此條件下牡蠣蛋白質(zhì)的水解度高達(dá)40.38%。

2）通過活性炭及美拉德反應(yīng)對(duì)牡蠣水解蛋白液脫腥技術(shù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：活性炭吸附及美拉德反應(yīng)兩種方法對(duì)酶解液的脫腥均能產(chǎn)生一定的效果；活性炭脫腥的最適條件是活性炭使用量2.5%、脫腥時(shí)間80 min、脫腥溫度45℃；美拉德反應(yīng)脫腥的最適條件是葡萄糖添加量3.0%、脫腥時(shí)間30 min、脫腥溫度100℃；綜合比較兩者的脫腥效果，美拉德反應(yīng)為較好的脫腥方法。

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