黃元坤 周志兵 周蕾蕾

AR與Mda9/syntenin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其意義

黃元坤 周志兵 周蕾蕾

目的探討研究雄激素受體(AR)與黑色素瘤分化相關(guān)基因9/配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白(Mda9/syntenin)在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其意義。方法80例三陰性乳腺癌組織，采用免疫組織化學(xué)法對(duì)其AR與syntenin的表達(dá)情況檢測(cè)，并探討二者與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系，采用 Kaplan-Meier生存曲線評(píng)價(jià)患者無(wú)病生存率，COX比例回歸模型進(jìn)行多變量分析。結(jié)果AR陽(yáng)性表達(dá)率為 37.50%，syntenin陽(yáng)性表達(dá)率為98.75%；AR與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)性(γs=-0.236，P<0.05)，syntenin與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)性(γs=0.296，P<0.05)，與腫瘤大小呈正相關(guān)性(γs=0.370，P<0.05)，與組織學(xué)分級(jí)也呈現(xiàn)正相關(guān)性(γs=0.230，P<0.05)；無(wú)病生存者占77.5%(62/80)，AR陰性與AR陽(yáng)性患者、不同程度AR表達(dá)程度與無(wú)病生存期(DFS)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，而syntenin不同表達(dá)程度與DFS存在相關(guān)性(P<0.05)；單因素分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響DFS的重要因素(P<0.05)，多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤>5 cm均是DFS危險(xiǎn)因素(P<0.05)。結(jié)論AR與患者的組織學(xué)分級(jí)相關(guān)、syntenin與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小呈正相關(guān)性，syntenin表達(dá)與DFS存在明顯關(guān)聯(lián)。

雄激素受體；黑色素瘤分化相關(guān)基因9；配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白；三陰性乳腺癌；臨床病理

近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率逐年升高，已成為惡性腫瘤致女性死亡的主要因素，其高發(fā)病率和高死亡率已對(duì)女性生活質(zhì)量造成極大威脅[1]。近年來(lái)相關(guān)研究證實(shí)[2]，雄激素受體(AR)與配體蛋白聚糖結(jié)合蛋白(syntenin)蛋白表達(dá)和三陰性乳腺癌臨床病理特點(diǎn)、臨床預(yù)后等均存在一定關(guān)聯(lián)，但尚需要深入探究。基于此，本研究特對(duì)80例三陰性乳腺癌組織中AR和syntenin表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，觀察2種蛋白在不同臨床病理特點(diǎn)下表達(dá)水平，并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集自2004年12月至2009年12月四川省人民醫(yī)院乳腺外科行改良根治術(shù)或保乳手術(shù)的80例三陰性乳腺癌患者的石蠟包埋組織塊及臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)乳腺外科行乳腺癌改良根治術(shù)或保乳手術(shù)并經(jīng)病理及免疫組化證實(shí)為三陰性乳腺癌；②病理類(lèi)型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；③術(shù)前未行新輔助化療，且術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④石蠟包埋組織塊完好，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其它類(lèi)型原發(fā)性惡性腫瘤，乳腺轉(zhuǎn)移者；②合并其它嚴(yán)重內(nèi)科疾病或系統(tǒng)性疾病者；③存在既往乳房手術(shù)史者。所有患者均為女性，年齡31～80歲，平均(52.67±13.32)歲，腫瘤大?。?2 cm 29例、>2 cm且≤5 cm 50例、>5 cm 1例。參照2012年WHO浸潤(rùn)性乳腺癌分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[3]，Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)31例，Ⅲ級(jí)44例。頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移54例，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移者26例，其中轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)≤3枚者13例，≥4且≤9枚者有7例，≥10枚者有6例。

1.2 方法

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 AR鼠抗人單克隆抗體(AR441)購(gòu)于中國(guó)上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司。兔抗多克隆syntenin抗體(ab19903)購(gòu)于中國(guó)深圳晶美生物科技開(kāi)發(fā)有限有限公司。EnVision試劑盒購(gòu)于DAKO公司。

1.2.2 AR和syntenin表達(dá)檢測(cè)方法 采用免疫組化法對(duì)AR和syntenin蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：①使用福爾馬林(濃度為10%)液固定，常規(guī)切片；②采用Envision免疫組化二步法進(jìn)行染色：于Poly-Lysine中將待測(cè)樣本浸泡5 min，取出后烤干待用，以4 μm厚度連續(xù)切片，完成后將其置于40 ℃恒溫器中，并分別平整粘附于兩張載玻片上；將載玻片置于60 ℃烤箱中120 min后取出，并分別置于二甲苯I和Ⅱ中10 min×2，取出后放入梯度酒精中(濃度分別為100%×2次，90%，80%)，4次×5 min；高壓修復(fù)抗原；③放入過(guò)氧化氫溶液(濃度為3%)中室溫孵育15 min，分別加入 100～150 μlAR鼠抗人單克隆抗體(一抗)，100～150 μl兔抗多克隆syntenin抗體(稀釋濃度為1∶150)，放入4 ℃冰箱中過(guò)夜；④PBS緩沖液沖洗3次×5 min，甩干后滴加100～150 μL即用型酶標(biāo)二抗，室溫條件下孵化30 min。PBS緩沖液沖洗3次×5 min，甩干后滴加50～100 μlDAB顯色劑，室溫孵育并于適度時(shí)終止顯色；⑤蘇木精輕度復(fù)染，脫水,透明,封片處理后采用顯微鏡觀察。

1.2.3 結(jié)果判讀 ①AR染色結(jié)果判讀：以細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕褐色顆粒沉積記為AR陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照：已知AR陽(yáng)性切片，陰性對(duì)照：PBS代替一抗。隨機(jī)選擇5個(gè)視野(200倍)，計(jì)算陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比率，<5%計(jì)為0分，5%～25%計(jì)為1分，25%～50%記為2分，≥50%記為3分；染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將陽(yáng)性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度分值總和作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(++)，3～4分為中等陽(yáng)性(++)，4分以上為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；②syntenin染色結(jié)果判讀：以胞質(zhì)呈棕色為syntenin陽(yáng)性染色。陽(yáng)性對(duì)照：已知陽(yáng)性的syntenin；陰性對(duì)照：PBS代替一抗。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(200倍)，染色強(qiáng)度(A)：不染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。染色細(xì)胞比率(B)：<5%計(jì)為0分，5%～25%計(jì)為1分，25%～50%記為2分，≥50%記為3分，將A與B相加再除以5作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)分大于50分為syntenin陽(yáng)性，最終評(píng)分0～50分為陰性(-)，51～100分為弱陽(yáng)性(+)，101～200分為中等陽(yáng)性(++)，201～300分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察AR與syntenin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況；分析AR、syntenin與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性；分析AR與syntenin表達(dá)情況與患者無(wú)病生存期(DFS)的關(guān)系；分析AR、syntenin及各個(gè)臨床參數(shù)與DFS的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0國(guó)際專(zhuān)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用spearman相關(guān)分析確定AR與syntenin表達(dá)情況和臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，并利用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)價(jià)無(wú)病生存率，另采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型行多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 AR與syntenin在三陰性乳腺癌中的表達(dá)情況

在80例中30(37.50%)例AR 表達(dá)陽(yáng)性。有79(98.75%)例syntenin表達(dá)陽(yáng)性。

2.2 AR、syntenin表達(dá)與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性

AR表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)性(γs=-0.236，P<0.05)，與淋巴結(jié)、年齡、組織學(xué)分級(jí)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；syntenin與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)性(γs=0.296，P<0.05)，與腫瘤大小呈正相關(guān)性(γs=0.370，P<0.05)，與組織學(xué)分級(jí)也呈現(xiàn)正相關(guān)性(γs=0.230，P<0.05)，與年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 AR和sytenin蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性/例

2.3 AR與syntenin表達(dá)與患者DFS的關(guān)系

80例患者均隨訪至2013年12月，隨訪率為100%，平均隨訪時(shí)間(57.26±10.21)個(gè)月，其中有18例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移：3例骨轉(zhuǎn)移，7例局部復(fù)發(fā)。9例死亡，死亡率為11.25%。無(wú)病生存者占77.5%(62/80)，AR陰性與AR陽(yáng)性患者DFS的關(guān)系見(jiàn)圖1(χ2=0.480，P=0.489)；不同程度AR表達(dá)與DFS的關(guān)系見(jiàn)圖2(χ2=0.240，P=0.076)；syntenin不同表達(dá)程度與DFS的關(guān)系見(jiàn)圖3(χ2=4.825，P=0.027)。

2.4 單因素分析

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響DFS的重要因素(χ2=27.358,P=0.0001)，而年齡、腫瘤大小、病理分級(jí)、AR表達(dá)、syntenin表達(dá)與DFS并無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.5 多變量回歸分析

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是獨(dú)立影響患者DFS的因素(P<0.05)， 且腫瘤直徑>5 cm為DFS的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

3 討論

三陰性乳腺癌者具有特殊的病理特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，常有中央壞死及推擠性邊緣，且增殖活性較高。此類(lèi)乳腺癌往往易復(fù)發(fā)、預(yù)后差。據(jù)報(bào)道，三陰性乳腺癌患者5年無(wú)轉(zhuǎn)移生存率約為70.9%，且三陰性乳腺癌手術(shù)切除后復(fù)發(fā)時(shí)間較其他類(lèi)型乳腺癌明顯縮短[4-5]。目前針對(duì)三陰性乳腺癌尚缺乏有效的靶向治療，難以取得滿(mǎn)意療效。因此對(duì)三陰性乳腺癌病理研究可為臨床治療提供全新方案[6]。本研究對(duì)AR與syntenin和三陰性乳腺癌病理特點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)研究二者表達(dá)情況對(duì)DFS的影響，以期為該病臨床治療提供全新思路和方向。

圖1 AR陰性與AR陽(yáng)性患者DFS的關(guān)系

圖2 不同程度AR表達(dá)與DFS的關(guān)系

圖3 不同程度syntenin表達(dá)與DFS的關(guān)系

臨床病理特征DFS/%χ2P年齡0.5060.477 ≤50歲18.92 >5025.58腫瘤大小5.0560.080 ≤2cm13.79 >2cm,≤5cm26.00 >5cm100淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27.358<0.0001 無(wú)5.56 有57.69病理分級(jí)2.060.151 Ⅰ0.00 Ⅱ18.52 Ⅲ28.26AR10.4780.489 -80.00 +73.33AR20.0110.916 (-)、(+)77.27 (++)和(+++)78.57Syntenin10.2940.588 -100.00 +77.22Syntenin23.8240.051 (-)、(+)94.44 (++)和(+++)72.58

3.1 AR與乳腺癌的關(guān)系

AR在乳腺癌的發(fā)展過(guò)程中作用顯著，但是確切的機(jī)制并不清楚。目前關(guān)于AR在三陰性乳腺癌中表達(dá)及臨床意義尚未得出統(tǒng)一意見(jiàn)。Agoff等在ER陰性的乳腺癌中通過(guò)單變量分析發(fā)現(xiàn)[7]，AR是 DFS的重要預(yù)后因子，但是多變量分析中發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。Rakha等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的三陰性乳腺癌中，AR陰性表達(dá)者局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率明顯較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者升高。Hu等發(fā)現(xiàn)[9]，在三陰性乳腺癌中AR陽(yáng)性表達(dá)者死亡率增高，但在Ivana等研究中發(fā)現(xiàn)AR與DFS和(或)OS無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)AR與組織學(xué)分級(jí)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，但AR與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)情況并無(wú)關(guān)系。采用多因素分析發(fā)現(xiàn)AR表達(dá)情況與患者的DFS無(wú)相關(guān)性，此結(jié)果可能與本研究樣本量不多有關(guān)。

3.2 syntenin與乳腺癌的關(guān)系

黑色素瘤分化相關(guān)基因9(Mda-9)具有PDZ-1和 PDZ-2結(jié)構(gòu)域，并被重新命名為syntenin[10]。Mda-9/syntenin在不同的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)將誘導(dǎo)形成褶皺、中板偽足、擴(kuò)展和軸突樣結(jié)構(gòu)，對(duì)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能調(diào)整意義重大。通過(guò)促使MCF-7或Az-521中mda-9過(guò)表達(dá)后，可明顯增強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[11-12]。相關(guān)研究指出[13]，syntenin在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)可能參與調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力，推測(cè)mda-9/syntenin可能對(duì)粘著斑激酶(FAK)磷酸化有重要促進(jìn)作用，并且可激活P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)和c-JNK表達(dá)。國(guó)內(nèi)有研究通過(guò)對(duì)160例乳腺癌組織采用免疫乳化法檢測(cè)SDCBP陽(yáng)性表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌組中syntenin表達(dá)明顯增強(qiáng)，且其表達(dá)水平與病理分級(jí)、腫瘤組織TNM分期呈正相關(guān)性，提示該蛋白表達(dá)水平和三陰性乳腺癌患者病理分級(jí)及腫瘤分期均存在一定關(guān)聯(lián)，可據(jù)此評(píng)估病情[14]。本研究結(jié)果中，syntenin陽(yáng)性表達(dá)率為98.75%，且其表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)均存在緊密關(guān)聯(lián)。與前文研究結(jié)論一致，表明在三陰乳腺癌中syntenin高表達(dá)很可能預(yù)示著不良預(yù)后。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同syntenin表達(dá)和DFS存在明顯關(guān)聯(lián)，提示syntenin可能對(duì)于患者生存期具有重要決定作用。

綜上所述，syntenin與三陰性乳腺癌患者組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈正相關(guān)性，推測(cè)syntenin高水平表達(dá)可能和與侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)。AR與組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，但和其它臨床特點(diǎn)均無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。AR表達(dá)和DFS均無(wú)相關(guān)性，而syntenin表達(dá)和DFS存在明顯關(guān)聯(lián)，推測(cè)后者可能對(duì)患者生存期有重要影響，但尚需要進(jìn)一步探討研究。

表3 多變量分析DFS的結(jié)果

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ExpressionandSignificanceofARandMda9/syntenininTripleNegativeBreastCancer

HUANGYuankun,ZHOUZhibing,ZHOULeilei.

ChengduFifthPeople'sHospital,Chengdu,611130

ObjectiveTo study the expression and significance of androgen receptor (AR) and ligand binding protein (Mda9/syntenin) in triple negative breast cancer.MethodsExpression of AR and Mda9/syntenin in 80 cases of triple negative breast cancer tissues were detected by immunohistochemical method,and the relationships with clinical pathological characteristics were analyzed.The Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate the disease free survival rate of patients,and the COX proportional regression model were used to carry out multivariate analysis.ResultsThe positive expression rate of AR was 37.50%,and the positive expression rate of syntenin was 98.75%.The expression of AR was negatively related with histological grading (γs=-0.236,P<0.05),while the expression of syntenin was positively related with lymph node metastasis (γs=0.296,P<0.05),and positively related with tumor size (γs=0.370,P<0.05),as well as with histological grading (γs=0.230,P<0.05).The disease free survival accounted for 77.5%(62/80).There had no significant differences in disease free survival (DFS) between the AR negative and AR positive patients,and different degrees of AR expression (P>0.05),while the different degrees of syntenin expressions were significantly correlated with DFS (P<0.05).The single factor analysis showed that lymph node metastasis was an important factor affecting the DFS (P<0.05),and the multi-factor analysis showed that both lymph node metastasis and tumor larger than 5cm were risk factors affecting DFS (P<0.05).ConclusionThe expression of AR is related with histological grading,and the expression of syntenin is positively related with histological grading,lymph node metastasis and tumor size,which is obviously related with DFS.

Androgen receptor (AR);Melanoma differentiation associated gene 9(Mda9);Ligand binding protein(syntenin);Triple negative breast cancer;Clinical pathology

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1763～1767)

611130 成都市第五人民醫(yī)院(黃元坤)；330000 南昌市第三人民醫(yī)院(周志兵)；610072 四川省人民醫(yī)院(周蕾蕾)

周蕾蕾

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.007

R737.9

A

1001-5930(2017)11-1763-05

2016-10-09

2017-07-10)

(編輯：吳小紅)