郗紅娟，靳 嵐，王鳳山，，郭學(xué)平

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院 生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟(jì)南 250012;2.山東大學(xué) 國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250100;3.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250108)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)廣泛存在于動(dòng)物的各種組織間質(zhì)中，不同來源的HA相互之間并無種屬差異，而且對(duì)人及動(dòng)物無抗原性［1］。HA是由相同的二糖單元重復(fù)排列而形成的無支鏈的直鏈高聚物，其中每個(gè)二糖單元由一個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以β-1，3糖苷鍵與葡萄糖醛酸(GlcA)組成，二糖單元間以β-1，4糖苷鍵連接。HA的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為106～107，HA經(jīng)過降解可以得到HA寡糖(oligosaccharide of hyaluronic acid，o-HA)，Mr在 1 ×104以下，其性質(zhì)與普通HA大不相同，甚至具有完全相反的作用［2］。研究表明，低MrHA片段和o-HA具有抗氧化［3］、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、促進(jìn)傷口愈合、促腫瘤血管生成［4］和抗腫瘤等活性。在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)方面o-HA和HA相比較具有明顯的差異性，HA可以促進(jìn)腫瘤的MDR，o-HA可以減弱HA與其受體的相互作用，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的抗凋亡途徑并且抑制MDR運(yùn)體的活性，進(jìn)而抑制腫瘤MDR［5］。雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)HA的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但是對(duì)于o-HA生物活性的了解還處于初級(jí)階段。

腫瘤細(xì)胞MDR是腫瘤細(xì)胞對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的化療藥物對(duì)其損傷的一種保護(hù)措施，是臨床化療治療惡性腫瘤過程中影響療效的最主要因素。腫瘤細(xì)胞MDR產(chǎn)生的機(jī)制極為復(fù)雜，包含多種可能的作用途徑與方式，主要有:(1)依賴ATP外排泵的相關(guān)蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，其中研究較多的包括糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)以及MDR相關(guān)蛋白(multidrug resistant protein，MRP)的異常表達(dá);(2)激活解毒系統(tǒng)，減少對(duì)藥物的吸收;(3)存活途徑的改變，如PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑(phosphatidylinositol 3-kinase-PI3K-/Akt)和凋亡途徑及相關(guān)細(xì)胞凋亡基因的變化等。近年來有關(guān)于o-HA與腫瘤及其MDR的相關(guān)性的研究報(bào)道，o-HA可降低腫瘤化療過程中的MDR。本文基于近年來發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)o-HA與腫瘤及其MDR相關(guān)性作一綜述。

1 HA、o-HA與腫瘤

1.1 HA、o-HA在腫瘤中的作用

HA不僅是細(xì)胞外基質(zhì)的重要的組成成分，而且可以通過與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合來促進(jìn)正常細(xì)胞的游走和腫瘤細(xì)胞的侵襲。因此，在與腫瘤的相互作用中，HA在腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲等方面發(fā)揮著重要的作用。HA可高度水合，使細(xì)胞柔韌性增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)細(xì)胞外形改變，提高組織滲透能力，HA為腫瘤細(xì)胞的入侵、轉(zhuǎn)移提供通道。HA在輔助腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用是通過其受體蛋白CD44的參與來完成的，在CD44對(duì)HA的吸收和降解作用下，高M(jìn)rHA有助于腫瘤細(xì)胞穿過基膜和細(xì)胞壁，最終完成自身的轉(zhuǎn)移［6］。o-HA對(duì)不同的腫瘤有不同的作用，其機(jī)制也不一樣［7］。Christian等［8］研究發(fā)現(xiàn)，o-HA(4 ～16 寡糖)能夠誘導(dǎo)人和鼠的具有免疫作用的樹突細(xì)胞的成熟，并促進(jìn)樹突細(xì)胞產(chǎn)生白介素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子。o-HA(6～7寡糖)能夠抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，在體外它們抑制不依賴于貼壁的腫瘤細(xì)胞的增殖［9］。o-HA(4～6寡糖)能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)尤其是 MMP-9和MMP-13表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲［10］。Mr為1 200～2 800的o-HA外源性地增加到胰腺癌細(xì)胞中，可大幅度地誘導(dǎo)CD44的裂解，而且已經(jīng)證明該Mr的o-HA的在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌以及肺非小細(xì)胞癌中可以增加CD44 的裂解［11］。單一的 o-HA(o-HA4，o-HA6，o-HA8，o-HA10)可逆轉(zhuǎn)耐阿霉素白血病細(xì)胞(K562/A02)耐藥，增加阿霉素在耐藥細(xì)胞內(nèi)的蓄積，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性［12］。

1.2 HA受體與腫瘤MDR的相關(guān)性

HA在維持細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)方面都起著重要的作用，與HA相關(guān)的受體主要有CD44、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白誘導(dǎo)物(Emmprin，即CD147)、HA介導(dǎo)細(xì)胞游走受體(receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM)和HA結(jié)合蛋白1(hyaluronan binding protein 1，HABP1)、TLR-4(Toll-like receptors 4)［13］等。HA與受體相互作用通過至少三個(gè)重要的生理學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié):信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體介導(dǎo)HA細(xì)胞內(nèi)吞作用、細(xì)胞外基質(zhì)的集合。每個(gè)階段都需要多個(gè)受體共同完成。這些受體和HA參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并為組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)提供條件。

CD44是一類跨膜糖蛋白，是細(xì)胞表面HA最重要的受體。CD44調(diào)節(jié)細(xì)胞的聚集、增殖、遷移和腫瘤血管發(fā)生。HA與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系是通過CD44受體胞內(nèi)部分與細(xì)胞骨架蛋白的相互作用來實(shí)現(xiàn)的［14］。因此，調(diào)節(jié)HA-CD44相互作用可以治療惡性腫瘤及對(duì)抗MDR中發(fā)揮重要的作用。4-甲基繖形酮(4-MU)是HA合成物的抑制劑，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均可降低乳腺癌耐藥細(xì)胞(JIMT-1)中HA的水平，使曲妥抗體與ErbB2的結(jié)合提高，增強(qiáng)ErbB2的衰減調(diào)節(jié)。經(jīng)4-MU處理的曲妥抗體對(duì)JIMT-1生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，揭示了HA-CD44途徑在針對(duì)腫瘤細(xì)胞受體靶向治療中的重要作用［15］。o-HA(3-9個(gè)雙糖單元)結(jié)合單價(jià)的CD44可以取代HA多聚體與膜受體結(jié)合，并抑制 HA的合成［16］，o-HA或CD44單抗能與CD44結(jié)合并阻止它啟動(dòng)可能導(dǎo)致藥物抗性的信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而部分逆轉(zhuǎn)耐藥。由于CD44對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致配基-受體系統(tǒng)通過對(duì)不同信號(hào)途徑中細(xì)胞周期靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)有絲分裂產(chǎn)生不同的作用。因此，不同Mr的HA與CD44的結(jié)合可以對(duì)細(xì)胞的周期進(jìn)展和增殖產(chǎn)生不同的影響［17］。

Emmprin是一種細(xì)胞表面免疫超基因家族糖蛋白，可以刺激HA的表達(dá)并調(diào)節(jié)下游區(qū)域信號(hào)。在多種惡性腫瘤系中Emmprin和CD44局部聯(lián)合[18]，HA、CD44和 Emmprin之間的相互作用已被證實(shí)可以在不同水平上影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，例如，在細(xì)胞生存信號(hào)通路及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和活性調(diào)節(jié)等方面，促成腫瘤細(xì)胞的糖酵解［19］;在HA介導(dǎo)下，Emmprin可以誘導(dǎo)人惡性腫瘤細(xì)胞中MMP的產(chǎn)生［14］，并且HA-Emmprin相互作用可以影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性和ErbB2的激活［19］。Emmprin同時(shí)也可以與各種單價(jià)羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(monocarboxylate transporters，MCT)相互作用，MCT轉(zhuǎn)運(yùn)由糖酵解產(chǎn)生的乳酸鹽，惡性腫瘤細(xì)胞則利用糖酵解途徑和乳酸鹽分泌導(dǎo)致腫瘤MDR。CD44和Emmprin在惡性乳腺癌細(xì)胞膜上與MCT1、MCT4相互作用。o-HA可以干擾質(zhì)膜HA-CD44相互作用，并下調(diào)Emmprin，使MCT1、MCT4的合成和聚集受到抑制，最終抑制乳酸鹽的外排［19］。

RHAMM是HA的結(jié)合蛋白，已經(jīng)被證明在惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中具有重要的作用。RHAMM和CD44在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有不同的作用，RHAMM和CD44在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中有不同的作用，例如CD44可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，而RHAMM則調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)移［14］。RHAMM在急慢性髓性白血病、結(jié)腸癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)，并且RHAMM的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［20］。RHAMM表達(dá)水平的升高與腫瘤的侵襲參數(shù)呈正向相關(guān)，可作為臨床檢測(cè)和療效的候選指標(biāo)，為腫瘤的診斷和治療提供參考。RHAMM在細(xì)胞表面結(jié)合HA，同時(shí)可以激活蛋白(質(zhì))酪氨酸激酶、成簇黏附激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

HABP1(hyaluronan binding protein 1)是HA黏素家族中的一員，能夠特異性地與HA結(jié)合。用抗HABP1的單抗對(duì)甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌組織進(jìn)行免疫組化染色，與它們各自的非惡變組織進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果顯示，HABP1在這些癌組織中呈高表達(dá);相反，在腎癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌中卻沒有這種表達(dá)差異。在HABP1高表達(dá)的腫瘤中的HA含量也是升高的，說明HA與HABP1間的相互作用可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［21］。

TLR是自身免疫系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)受體。HA與TLR-4相互作用促進(jìn)NF-kB的表達(dá)，從而使MMP-2表達(dá)量增多，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，HA可以作為研究腫瘤和免疫機(jī)制的關(guān)系的受體［22］。不同的TLR受體可能對(duì)不同的長(zhǎng)度的HA片段有不同的應(yīng)答反應(yīng)，TLR-4是o-HA(4～6個(gè)二糖單元)的受體，在黑色素瘤細(xì)胞中o-HA部分依賴TLR-4并通過誘導(dǎo)MMP和細(xì)胞因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲［9］，HA片段可以在損傷位點(diǎn)刺激炎癥因子基因的表達(dá)，在炎癥細(xì)胞中HA片段信號(hào)通過TLR-4、TLR-2和CD44結(jié)合刺激炎性基因，HA和HA結(jié)合蛋白通過炎癥細(xì)胞的募集、炎性因子的釋放和細(xì)胞的轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)炎癥及對(duì)組織損傷的修復(fù)。

2 o-HA可以抑制MDR

腫瘤細(xì)胞MDR是腫瘤細(xì)胞對(duì)不同結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的化療藥物對(duì)其損傷的一種保護(hù)措施，是臨床化療治療惡性腫瘤過程中影響療效的最主要因素。腫瘤細(xì)胞MDR產(chǎn)生的機(jī)制極為復(fù)雜，包含多種可能的作用途徑與方式。近幾年，HA與受體之間的相互作用已被證實(shí)可以在不同水平上影響腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性，例如，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系間的差異性影響，調(diào)節(jié)細(xì)胞生存信號(hào)通路，調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和活性，以及糖酵解的表達(dá)等。近年來研究較多的包括MDR1基因編碼的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵糖蛋白P-gp以及MRP的表達(dá)異常，信號(hào)傳導(dǎo)通路PI3K/Akt中與細(xì)胞調(diào)亡和抑制有關(guān)的基因?qū)DR的影響也開始受到關(guān)注。

2.1 o-HA通過抑制PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑來抑制MDR

細(xì)胞生存途徑/抗凋亡途徑水平的提高是腫瘤細(xì)胞中常有的現(xiàn)象，是主要的促抗藥性的因素。PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑會(huì)影響細(xì)胞的多種生物學(xué)活性，主要包括細(xì)胞的增殖、存活和凋亡、血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移以及MDR。PI3K/Akt是抗細(xì)胞凋亡途徑，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，受體酪氨酸激酶可以調(diào)節(jié)其活性，可增加ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，如P-gp蛋白和BCRP等［23］。在體外實(shí)驗(yàn)中，HA利用PI3K依賴機(jī)制，通過激活T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移(T-lymphoma invasion and metastasis，Tiam1)誘導(dǎo)多藥耐藥淋巴細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移［5］。o-HA對(duì)HA的干擾作用可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及敏化抗有絲分裂的癌細(xì)胞［24］。Ghatak等［25］研究表明，o-HA通過促進(jìn)腫瘤抑制基因(PTEN)的表達(dá)，抑制PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路而抑制腫瘤細(xì)胞。NF-kB(nuclear factor-kB)和PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑都可以抑制細(xì)胞凋亡，在淋巴癌細(xì)胞系中用o-HA和渥曼青霉素抑制PI3K來降低Akt的磷酸化水平逆轉(zhuǎn)耐藥，卻不能抑制NF-kB的活性，作用機(jī)制與天然的HA不同［26］。o-HA通過調(diào)節(jié)P-gp和PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑的活性使耐長(zhǎng)春新堿淋巴瘤細(xì)胞的敏感性增強(qiáng)，可與經(jīng)典的化學(xué)療法聯(lián)合治療耐藥的惡性腫瘤。o-HA還可以抑制HA-CD44的相互作用進(jìn)而導(dǎo)致ErbB2活性的降低，從而降低PI3K/Akt細(xì)胞存活途徑的活性和其他信號(hào)途徑的衰減(如有絲分裂原激活蛋白酶和成簇黏附激酶途徑)［27］。

2.2 o-HA通過抑制MRP的表達(dá)來抑制MDR

HA-CD44與蛋白激酶C相互作用通過促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)記物nanog和微小-RNA21的產(chǎn)物促進(jìn)致癌信號(hào)的產(chǎn)生，導(dǎo)致了腫瘤抑制蛋白表達(dá)的下調(diào)，以及凋亡抑制劑和MRP表達(dá)的上調(diào)［28］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，HA-CD44的相互作用可以調(diào)節(jié)ABC家族藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體如P-gp蛋白和BCRP等的表達(dá)［29］，誘導(dǎo)聯(lián)接蛋白結(jié)合Pgp導(dǎo)致化療藥物的外排和化藥耐藥性。HA-CD44對(duì)胞漿膜的轉(zhuǎn)運(yùn)體具有局部化穩(wěn)定作用，CD44可以在腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜中與P-gp蛋白和BCRP局部聯(lián)合，兩者可以協(xié)同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲［30］，例如，Pgp與CD44相互作用促進(jìn)乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞增值和入侵［5］。用o-HA可以減弱HA-CD44的相互作用，可以引起CD44轉(zhuǎn)運(yùn)體的降解和誘導(dǎo)CD44、BCRP和Pgp的細(xì)胞內(nèi)攝作用，敏化阿霉素對(duì)惡性外周神經(jīng)鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumors，MPNST)的治療［29］，因此 o-HA 可以抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性和提高M(jìn)PNST對(duì)阿霉素治療的敏感性［31］，同時(shí)抑制Pgp底物鈣離子熒光探針(FURA 2-AM)的外排及HA的分泌。如果對(duì)腫瘤細(xì)胞采用肌動(dòng)蛋白聚合物的抑制劑進(jìn)行聯(lián)合治療，那么o-HA誘導(dǎo)的CD44和轉(zhuǎn)運(yùn)體的內(nèi)吞作用將被抑制［18］。o-HA和CD44單抗的干預(yù)均能夠降低耐順鉑的肺癌細(xì)胞(A549/DDP)中HA的表達(dá)，經(jīng)過處理的耐藥細(xì)胞的各種耐藥蛋白的表達(dá)率明顯降低，表明o-HA或CD44單抗可能是通過抑制MDR蛋白的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)順鉑類藥物的耐藥［32］。

2.3 o-HA通過誘導(dǎo)凋亡調(diào)控蛋白的表達(dá)來抑制MDR

bcl-2和p53均為凋亡調(diào)控蛋白，bcl-2抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，而p53可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，p53表達(dá)上調(diào)或bcl-2下調(diào)均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到一定程度逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。在敲除CD44的小鼠模型中，結(jié)腸上皮細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡水平提高，通過線粒體途徑伴隨著caspases3和9的激活，Bcl-xl表達(dá)的降低，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)器的廢除，以及線粒體嵴的破裂。相反的，CD44的過表達(dá)可抑制耐藥細(xì)胞凋亡［14］。o-HA的干預(yù)能增強(qiáng)耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/ADM)對(duì)化療藥ADM的敏感性，使ADM對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷性增強(qiáng)，并可增加胞內(nèi)化療藥物的濃度以逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥性。經(jīng)過處理后的耐藥細(xì)胞，耐藥蛋白P-gp和MRP的表達(dá)率明顯降低，p53表達(dá)上調(diào)，表明o-HA可能通過抑制MDR蛋白的表達(dá)以及調(diào)控凋亡蛋白來逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)ADM 的耐藥［33］。

3 展望

臨床應(yīng)用的HA拮抗劑，如o-HA或CD44單抗能夠部分逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞藥物抗性，o-HA無毒副作用、無免疫抗原，更能顯示其臨床應(yīng)用的優(yōu)越性，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，o-HA具有開發(fā)成腫瘤MDR抑制劑的前景。深入研究o-HA的抗腫瘤活性及其在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR方面可能發(fā)揮的作用途徑與方式，將為進(jìn)一步了解o-HA抑制腫瘤細(xì)胞及其逆轉(zhuǎn)MDR的作用提供良好的理論基礎(chǔ)。

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