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siRNA的定量方法及其在藥代動(dòng)力學(xué)檢測中的應(yīng)用

2012-08-15 00:48:20侯召麗王艷玲王雅鵑高玉青戴偉業(yè)李春雷
中國生化藥物雜志 2012年4期
關(guān)鍵詞:藥代核苷酸定量

侯召麗,王艷玲,王雅鵑,高玉青,戴偉業(yè),李春雷

(石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)(石家莊)有限公司,河北 石家莊 050051)

1 RNA干擾(RNA interference,RNAi)與小干擾 RNA(Small interfering RNA,siRNA)

RNAi是指由雙鏈RNA啟動(dòng)的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物中。RNAi最主要的功能特色在于它可以下調(diào)或關(guān)閉特定基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各項(xiàng)高級生命活動(dòng),這不僅提升了人們對RNA分子的認(rèn)識(shí),更為各種傳染性疾病的防治和腫瘤等醫(yī)學(xué)頑癥的根治開辟了一條新的途徑[1]。目前,RNAi技術(shù)已應(yīng)用于病毒性疾病研究、惡性腫瘤的治療、新藥的研究和開發(fā)等領(lǐng)域。

siRNA是一種小雙鏈RNA分子,能夠與核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC),引發(fā) RNAi機(jī)制,干擾特異基因的表達(dá),從而使與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA沉默。siRNA具有特異性和高效性的特點(diǎn),能夠通過這種機(jī)制沉默某些可引發(fā)疾病的基因,現(xiàn)已成為許多疾病的潛在的治療藥物。

2 siRNA的藥代動(dòng)力學(xué)特性

核酸類藥物與傳統(tǒng)的藥物相比,最顯著的一個(gè)特性是易受到體內(nèi)核酸酶的作用而迅速降解。據(jù)報(bào)道[2],siRNA極不穩(wěn)定,在血漿中由于核酸酶的存在,siRNA的半衰期不足15 min;另外,由于siRNA大小只有20~25個(gè)堿基,使用傳統(tǒng)的PCR方法引物很難結(jié)合上去不利于測定;siRNA在體內(nèi)的殘留量少,濃度低,檢測困難,這些都為siRNA藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究帶來困難。而對藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、疾病對其藥代動(dòng)力學(xué)過程的影響規(guī)律、合并用藥對其藥代動(dòng)力學(xué)過程的影響規(guī)律等方面的研究,能夠?yàn)樗幬锏呐R床評價(jià)、臨床應(yīng)用方法、臨床個(gè)體化給藥方案的制定提供理論依據(jù),對提高治愈率、縮短治療時(shí)間、減少或消除毒副作用等發(fā)揮著積極的作用。

因此,設(shè)計(jì)合適的實(shí)驗(yàn)方案、建立準(zhǔn)確可信的藥代動(dòng)力學(xué)研究方法對siRNA藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

3 siRNA的定量方法

3.1 PCR定量法

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time Quantitative PCR,qRTPCR)通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測,它的主要優(yōu)點(diǎn)是可以準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)、寬的動(dòng)態(tài)范圍及高的靈敏度。目前已有許多基于SYBR Green I或者TaqMan探針采用qRT-PCR對RNA進(jìn)行定量的策略,這些方法具有操作簡便、重復(fù)性好、敏感度高等優(yōu)點(diǎn),多種siRNA定量方法也基于該原理。

3.1.1 引物延長定量PCR(Primer-Extension quantitative PCR,PE-qPCR)PE-qPCR方法依賴于RNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄過程,該方法包括兩步反應(yīng):第一步反轉(zhuǎn)錄,即將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,該反轉(zhuǎn)錄過程使用一個(gè)基因特異性引物(gene-specific primer,GSP),該引物由基因特異區(qū)和延長區(qū)兩部分組成,可以將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,同時(shí)引入一個(gè)萬能PCR結(jié)合位點(diǎn)將cDNA鏈延長;第二步熒光定量PCR,在第一個(gè)循環(huán)中,使用含有2'-O,4'-C亞甲基化橋(methylene brigde)的鎖定核酸序列(locked nucleic acids,LNA)作為反向引物對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,在隨后的反應(yīng)循環(huán)中,萬能引物作為正向引物和LNA-R作為反向引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),通過檢測SYBR Green的熒光信號對siRNA進(jìn)行定量。這種方法可以在106~107范圍內(nèi)對siRNA的濃度進(jìn)行檢測,能夠區(qū)分有微小序列差異的 siRNA[3]。

該方法通過使用基因特異性引物延長cDNA的長度有利于對小分子siRNA的檢測,而LNA中的2'-O,4'-C亞甲基化橋可以穩(wěn)定糖基,增加寡核苷酸的雜交親和力。

但是,該方法在熒光定量前需將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在提取siRNA和反轉(zhuǎn)錄的過程中不可避免的會(huì)造成siRNA的降解和損失,因此會(huì)造成測定濃度比實(shí)際濃度低的情況。并且由于反轉(zhuǎn)錄效率的差異,導(dǎo)致該方法的重現(xiàn)性較差。另外,在轉(zhuǎn)錄引物L(fēng)NA-R中引入亞甲基化橋,合成引物較復(fù)雜,并且該方法不能區(qū)分已降解的和完整的siRNA。

3.1.2 莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄PCR(Stem-loop RT-PCR) Stem-loop RT-PCR方法同樣包括兩步反應(yīng)。在第一步反轉(zhuǎn)錄過程中使用Stem-loop反轉(zhuǎn)錄引物,該引物形成一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以結(jié)合到小核苷酸片段的3'末端,對其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,這種莖環(huán)引物在反轉(zhuǎn)錄效率和特異性方面都優(yōu)于傳統(tǒng)引物;在第二步熒光定量PCR反應(yīng)中加入基因特異性的上游引物、下游引物以及特異性的TaqMan探針進(jìn)行PCR反應(yīng),Taqman探針對于siRNA是特異的,并且能夠區(qū)分出一個(gè)核苷酸之差的siRNA,不受基因組DNA污染的影響,反應(yīng)過程中通過檢測TaqMan探針的熒光值變化來定量小核苷酸。該方法具有高敏感性、高特異性、高精確性的特點(diǎn),并且,無需對核酸進(jìn)行純化就可對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行直接分析[4]。

該方法使用TaqMan探針,特異性好,背景干擾較低,并且能夠區(qū)分出已降解的siRNA和完整的siRNA,通過使用Taqman探針,能夠檢測不同的siRNA,節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用,具有較高的特異性、敏感性、和精確性;使用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物延長了cDNA,有利于對小片段siRNA的檢測,并且該方法較為簡單、快捷。但該方法也需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄步驟,反轉(zhuǎn)錄效率的差異將會(huì)導(dǎo)致siRNA定量的不準(zhǔn)確。

3.1.3 小目標(biāo)定量PCR(Small-target Quantitative PCR,SQPCR)SQPCR方法首先使用T4 DNA連接酶將兩個(gè)與小核苷酸片段部分配對的片段連接起來。然后使用一個(gè)包含M13 Fwd的上游引物和包含M13 Rev的下游引物位點(diǎn)的5'寡核苷酸和3'寡核苷酸對連接片段進(jìn)行擴(kuò)增[5]。這種形式的2個(gè)酶連片段可對任何長短的核酸片段進(jìn)行檢測和定量,具有強(qiáng)大的應(yīng)用范圍。

該方法通過將兩個(gè)片段連接起來以延長核酸片段的長度,有利于檢測的進(jìn)行。這種方法具有廣譜性,兩個(gè)酶連片段的序列只需達(dá)到連接部分與siRNA序列互補(bǔ),對于不同siRNA的檢測,只需改動(dòng)兩個(gè)片段中與siRNA互補(bǔ)的地方即可,通用引物M13 Fwd/M13 Rev可對不同的序列進(jìn)行檢測和定量。

但是這個(gè)方法不能區(qū)分已降解的siRNA和完整的siRNA,并且由于需要連接酶進(jìn)行連接,對于過程中的連接效率無法進(jìn)行定量,連接效率的差異會(huì)對PCR結(jié)果產(chǎn)生很大的誤差,導(dǎo)致該方法的重復(fù)性差。

3.1.4 彎曲發(fā)夾方法(Crook Hairpins)Crook Hairpins方法檢測的siRNA需要在3'端連接上一段DNA,這段siRNADNA結(jié)構(gòu)既可作為功能基因引發(fā)mRNA的沉默又可作為PCR擴(kuò)增的引物,用于siRNA的定量檢測[6]。并且siRNA 3'端DNA末端能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以防止核酸酶對siRNA的降解。該方法需要構(gòu)建一個(gè)與siRNA互補(bǔ)配對的質(zhì)粒作為模板,利用樣品中未知的siRNA作為“上游引物”進(jìn)行PCR反應(yīng),由于加入的下游引物和質(zhì)粒模板是過量的,擴(kuò)增片段的多少與“上游引物”即siRNA的量成正比,通過檢測產(chǎn)物量的變化就能對siRNA進(jìn)行定量。

siRNA-DNA結(jié)構(gòu)可以作為PCR擴(kuò)增的“引物”,省去了反轉(zhuǎn)錄步驟,具有較好的特異性、重現(xiàn)性,使用該方法可以對siRNA進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。但缺點(diǎn)是方法較復(fù)雜,需對siRNA進(jìn)行特殊修飾(連接一段DNA序列)以及構(gòu)建質(zhì)粒模板。

3.1.5 競爭定量PCR(Competitive Quantitative PCR,cqPCR)

cqPCR使用siRNA與同源性的DNA引物競爭模板DNA,siRNA結(jié)合到模板上后可阻止擴(kuò)增反應(yīng)。在Taq酶的作用下,3'端被2'-O-甲基化酶修飾的siRNA不能作為引物參與DNA的延伸。siRNA作為競爭引物,在其最低濃度為6.25 nmol/L時(shí),模板DNA和 Ct值(Threshold Cycle,實(shí)測熒光值達(dá)到設(shè)定值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù))之間呈較好的線性關(guān)系,在這種條件下,加入序列特異性siRNA可使Ct值呈現(xiàn)siRNA劑量依賴性線性增加,因此,能夠通過Ct值的變化來定量siRNA。2'-O-甲基化酶修飾的 siRNA在血清中可阻止模板的復(fù)制,沒有修飾過的siRNA、被核酸酶降解的或是錯(cuò)配的siRNA都不能阻止模板的復(fù)制,這就保證了siRNA的序列特異性,并能夠區(qū)分降解的和非降解的siRNA序列[7]。

cqPCR不需RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的過程,避免操作過程中造成的損失,并可鑒定完整的siRNA;cqPCR避免了因?yàn)閟iRNA太小給傳統(tǒng)qPCR帶來的弊端,它是用競爭引物與模板的結(jié)合來定量而不是利用模板的拷貝數(shù)來定量,具有很好的特異性和準(zhǔn)確性,可對siRNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

但是該方法需要對條件進(jìn)行優(yōu)化,如模板DNA的量、上游引物的濃度及退火、延伸溫度等。

3.2 侵入檢測(Invader Assay)

侵入檢測方法依賴于目標(biāo)小核苷酸片段、探針和invasive oligo(侵入寡聚核苷酸)之間形成一個(gè)重疊的結(jié)構(gòu),探針和invasive oligo分別與siRNA部分互補(bǔ),相交處部分重疊,形成一個(gè)結(jié)構(gòu)特異性酶的的識(shí)別位點(diǎn),通過該酶的切割,探針釋放出一段5'-flap。在第二步反應(yīng)中,首先加入捕獲核苷酸(Arrestor oligo),結(jié)合第一步反應(yīng)中未參與反應(yīng)的探針,以防探針結(jié)合到第二個(gè)反應(yīng)模板上,隨后加入第二個(gè)反應(yīng)模板和FRET(fluorescence resonance energy transfer,熒光共振能量轉(zhuǎn)移)寡核苷酸片段,第一步反應(yīng)釋放的5'-flap能夠與第二個(gè)反應(yīng)模板和FRET寡核苷酸片段形成與第一步反應(yīng)相同的結(jié)構(gòu),通過酶的作用釋放出FRET寡核苷酸片段上的熒光信號,通過對熒光信號的檢測來定量小核苷酸片段。該方法可以區(qū)分出一個(gè)核苷酸之差的小核苷酸片段,并且在細(xì)胞裂解液中使用熒光檢測只需2~3 h的孵化時(shí)間[8]。

侵入檢測方法的優(yōu)點(diǎn)是敏感性好,只需少量siRNA就可以對siRNA進(jìn)行定量,并可以區(qū)分出一個(gè)核苷酸之差的siRNA,同時(shí)該方法較快捷,反應(yīng)只需2~3 h的孵化時(shí)間。但是該方法需要兩次酶切,兩步反應(yīng)受到多方面因素的影響,均需要確定反應(yīng)的最佳條件,由于酶切效率的差異,會(huì)造成結(jié)果失真,影響siRNA的定量,且該方法需要合成不同的寡核苷酸片段用于檢測,過程復(fù)雜。

3.3 ELISA定量檢測法

ELISA定量檢測法首先對siRNA進(jìn)行標(biāo)記,siRNA正義鏈5'端標(biāo)記上生物素作為捕獲標(biāo)記,反義鏈5'端標(biāo)記上二硝基酚(DNP)作為檢測標(biāo)記。細(xì)胞裂解液或是血清中標(biāo)記的雙鏈定量siRNA(double-stranded QsiRNAs,dsQsiRNA)使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋,然后將siRNA孵化在鏈霉素包被的96孔板中,逐次加入一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育,最后加入底物(TMB)并終止反應(yīng),通過對底物的熒光檢測來反映siRNA的量。該方法的線性范圍在10~100 fmol/mL,靈敏度很高(最低檢測限度5.4 fmol/mL),比熒光定量方法的敏感度高629倍。在單鏈siRNA存在的條件下,它的檢測信號的強(qiáng)度可降低到本底水平,具有靈敏度高,背景干擾弱,特異性強(qiáng),重現(xiàn)性較好等優(yōu)點(diǎn),并可對完整的雙鏈siRNA進(jìn)行定量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以ELISA為基礎(chǔ)的定量法可用于評估化學(xué)修飾的siRNA和陽離子載體系統(tǒng),尤其是在藥物動(dòng)力學(xué)方面有較大的前景[9]。但是該方法的影響因素很多,如固相載體、洗滌劑與稀釋劑、底物等,容易造成結(jié)果失真;且體外化學(xué)合成的siRNA雙鏈均需要熒光標(biāo)記,合成修飾的費(fèi)用昂貴,且修飾后的siRNA對其功能是否有影響仍不得而知。

4 討論

siRNA能夠引發(fā)RNAi程序,干擾特異基因的表達(dá)的特點(diǎn),使其成為國內(nèi)外藥物研發(fā)的新熱點(diǎn),但siRNA只有20~25個(gè)堿基,利用傳統(tǒng)的PCR方法引物難以結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增,對于檢測和定量來說都是很大的挑戰(zhàn);并且siRNA作為藥物進(jìn)入動(dòng)物或人體后,會(huì)被血液中的核酸酶部分或完全降解,如何將完整的siRNA和不完整的siRNA區(qū)分開來,以及如何對完整的siRNA進(jìn)行準(zhǔn)確的定量是siRNA藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究和藥物研發(fā)中的難題。目前,已報(bào)道了多種定量siRNA的方法,但這些定量方法應(yīng)用于siRNA檢測各有利弊。

siRNA藥物的制備方法不同,其適用的檢測方法也不同。最常見siRNA制備方法是體內(nèi)載體表達(dá)和體外化學(xué)合成修飾,對于通過體內(nèi)載體表達(dá)的方法,其在血液中是以載體的形式存在,對于其藥代動(dòng)力學(xué)檢測則可使用傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法;而對于化學(xué)合成的siRNA在血液中表現(xiàn)上述特點(diǎn),因此,其檢測方法需要進(jìn)一步討論。

根據(jù)定量時(shí)是否將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA可以將定量方法分為兩類,一類需要將siRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA然后進(jìn)行定量;另一類是對siRNA直接進(jìn)行定量。PE-qPCR和Stemloop RT-PCR法屬于第一類定量方法。由于在提取siRNA和反轉(zhuǎn)錄的過程中不可避免的會(huì)造成siRNA的降解和損失,因此,會(huì)造成測定濃度比實(shí)際濃度低,對于含微量siRNA的血液樣品,該類方法可能由于損失而造成檢測結(jié)果失真。

另外幾種方法中侵入檢測方法使用切割酶對特異性位點(diǎn)進(jìn)行切割,由于酶切效率的影響不可避免的會(huì)造成定量的不準(zhǔn)確性。與侵入檢測方法類似,Ligation Assay中用到了連接酶,對于連接過程中的連接效率無法估算,也存在定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差的問題。

Crook Hairpins方法使用了siRNA-DNA結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)既可以作為功能基因引發(fā)mRNA的沉默又可以作為PCR擴(kuò)增的引物,在這種方法中siRNA是作為“引物”,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的量來直接對其進(jìn)行定量,但其需要對siRNA進(jìn)行特殊修飾,過程復(fù)雜,且在實(shí)際應(yīng)用中,這種siRNA-DNA片段是否具有功能還需討論。

ELISA定量檢測法與PCR法和侵入檢測方法不同的是,它對siRNA進(jìn)行了雙標(biāo)記,然后利用抗體的特異性結(jié)合以及酶對底物的高效生物催化作用對極微量的siRNA雙鏈進(jìn)行定量檢測。ELISA定量檢測法的靈敏度明顯高于熒光定量方法。但是由于ELISA過程會(huì)受到很多因素的影響,如固相載體、洗滌劑與稀釋劑、底物等,每一個(gè)環(huán)節(jié)出了差錯(cuò)都會(huì)影響定量結(jié)果,所以很容易造成結(jié)果的失真,并且對于siRNA標(biāo)記后在體內(nèi)是否能起抑制作用仍需證實(shí)。

cqPCR法與Crook Hairpins方法類似,在該方法中siRNA雖然不能作為引物誘導(dǎo)DNA的擴(kuò)增,但是卻使用siRNA與同源性的DNA引物競爭模板DNA,siRNA結(jié)合到模板上后可阻止PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行,用間接競爭法來進(jìn)行siRNA的定量。該方法不經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄過程,避免了提取和反轉(zhuǎn)錄過程造成的損失和誤差,且該方法檢測的靈敏度高,并可使用血清樣品直接檢測,定量過程簡便,同時(shí)還可區(qū)分出完整的和降解的siRNA。

除上述介紹的方法之外,文獻(xiàn)還報(bào)道其它用于siRNA定量的方法。Northen Blot是檢測和定量RNA的常用方法,但是Nothern Blot反應(yīng)過程復(fù)雜,要求條件嚴(yán)格,且該方法的靈敏度低,定量精度低,因此,認(rèn)為該方法并不適用于血液中的微量siRNA藥物的精確定量檢測。而Microarray和基于Microarray(如mirMASA[10])的一些方法適用于 siRNA的高通量檢測,但這類方法存在反應(yīng)條件難以控制、選擇性不夠以及反應(yīng)靈敏度低的問題。其它方法,例如Signal-amplifying Ribozymes(信號放大核酶法)[11],通過設(shè)計(jì)對目標(biāo)有活性的核酶,使其與5'端標(biāo)記為熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記為淬滅基團(tuán)的小核苷酸片段的片段反應(yīng),經(jīng)過核酶酶切后釋放出熒光信號,經(jīng)過對熒光信號強(qiáng)度的檢測來定量小核苷酸片段。該方法靈敏度高,能夠區(qū)別出完整的和已降解的siRNA序列。但是該方法需要設(shè)計(jì)有活性、并且特異性針對siRNA的核酶,過程復(fù)雜,操作困難;而且siRNA需要標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),價(jià)格昂貴,并且可能影響其在體內(nèi)的抑制活性。

綜上所述,在這些siRNA定量方法中,cqPCR方法相對于其它方法更為簡單、方便、實(shí)用,該方法的敏感度高、重復(fù)性好、且能夠特異的檢測出生物樣品中完整的雙鏈siRNA和降解的siRNA,siRNA本身不需要特別的修飾,是應(yīng)用于siRNA藥代動(dòng)力學(xué)檢測較為理想的方法。但是,如何建立一個(gè)特異性好、敏感性強(qiáng)的siRNA藥代動(dòng)力學(xué)定量方法,用于完整有功能的siRNA檢測,仍需要我們不斷摸索完善。

[1] Carthew R,Sontheimer E.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136:642-655.

[2] Soutschek J,Akinc A,Bramlage B,et al.Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs[J].Nature,2004,432(7014):173-178.

[3] Raymond C,Roberts B,Garrett-Engele P,et al.Simple,quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs[J].RNA,2005,11:1737-1744.

[4] Chen C,Ridzon D,Broomer A,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005,33:e179.

[5] Duncan D,Eshoo M,Esau C,et al.Absolute quantitation of microRNAs with a PCR-based assay[J].Anal Biochem,2006,359:268-270.

[6] Jiang M,Arzumanov A,Gait M,et al.A bi-functional siRNA construct induces RNA interference and also primes PCR ampli?cation for its own quanti?cation[J].Nucleic Acids Res,2005,33:e151.

[7] Liu W,Stevenson M,Seymour L,et al.Quanti?cation of siRNA using competitive qPCR[J].Nucleic Acids Res,2009,37:e4.

[8] Allawi T,Dahlberg E,Olson S,et al.Quantitation of microRNAs using a modi?ed Invader assay[J].RNA,2004,10:1153-1161.

[9] Kima E,Park T,Oh Y,et al.Assessment of siRNA pharmacokinetics using ELISA-based quanti?cation[J].J Controlled Release,2010,143:80-87.

[10] Barad O,Meiri E,Avniel A,et al.MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays:System establishment and expression profiling in human tissues[J].Genome Res,2004,14:2486-2494.

[11] Hartig J,Grune I,Najafi-Shoushtari S,et al.Sequence-specific detection of microRNAs by signal-amplifying ribozymes[J].J Am Chem Soc,2004,126:722-723.

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