吳伯英

生物鑒定法是近年來興起的一種中藥品質(zhì)鑒定新方法，它和傳統(tǒng)的基原鑒定法、性狀鑒定法、顯微鑒定法、理化鑒定法一起，并稱為中藥的五大鑒定法。生物鑒定法具有先進(jìn)性、適用性、可操作性和專屬性強(qiáng)等特征，并且能夠突出中藥的藥效學(xué)作用，準(zhǔn)確性高。

生物鑒定(bioassay)法又稱“生物檢定”或“生物測定法”。是利用中藥或其所含的化合物對生物體(organism)的作用強(qiáng)度，以及用DNA特異性遺傳標(biāo)記特征和基因表達(dá)差異等來鑒別中藥的品種和質(zhì)量的一種方法。通常分為生物效應(yīng)鑒定法和基因鑒定法兩大類。生物效應(yīng)鑒定法是利用藥物對于生物(整體或離體組織)所起的作用，測定藥物生物活性(biological activity)強(qiáng)度或藥理作用，以鑒別中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的方法。該法以藥理作用和分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗方法和病理模型，通過被測物與相應(yīng)的對照品在一定條件下比較其產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量比例，測出藥物的活性作用。常用的方法有免疫鑒定法、細(xì)胞生物學(xué)鑒定法、生物效價測定法、單純指標(biāo)測定法、DNA遺傳標(biāo)記鑒定法、mRNA差異顯示鑒定法等[1]。

1 生物鑒定法

1.1 免疫鑒定法

免疫鑒定法是利用中藥含有的特異蛋白為抗原制備的特異抗體，與供試品中特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)的一種方法，可準(zhǔn)確地鑒別中藥品種。不同的動植物藥材含有不同的特異蛋白，免疫鑒別即用該蛋白制備的特異抗體與待檢品中的特異抗原結(jié)合產(chǎn)生沉淀反應(yīng)來鑒別藥材的真?zhèn)蝃2]。該技術(shù)適用于動物藥材的鑒別，尤其是親緣關(guān)系比較接近的動物藥間的鑒別[3]。國內(nèi)學(xué)者采用免疫電泳法及瓊脂免疫擴(kuò)散法準(zhǔn)確鑒定了虎、豹等多種動物的骨骼，還能將豹骨進(jìn)一步鑒定為雪豹、石豹或金錢豹，說明免疫鑒定方法是一種特異性很強(qiáng)的鑒別法[4]。免疫鑒定法還可以采用酶標(biāo)法和單克隆抗體法進(jìn)一步深入研究[5]。有待成為動物類中藥材鑒定中的主流技術(shù)。

1.2 細(xì)胞生物學(xué)鑒定法

細(xì)胞生物學(xué)鑒定法主要采用染色體的分類技術(shù)對中藥進(jìn)行鑒別。中藥某個特定種群的生物體細(xì)胞中染色體的形態(tài)、組型是穩(wěn)定不變的，代表該種群的基本遺傳特征，根據(jù)該特征即可鑒定中藥的品種，適用于果實和種子類中藥的鑒定，將需鑒定的藥材培養(yǎng)發(fā)芽后，取根尖制片，觀察并找到較好的染色體排列，制成核型模式圖。測定染色體長臂和短臂長度，計算同源染色體相對長度及臂長比值、著絲點指數(shù)、差值，求出核型公式，根據(jù)“不對稱核型分類”標(biāo)準(zhǔn)確定其核型，與已知該植物染色體的背景資料比較，即可確定藥材種屬。該方法已被用于中藥梔子等的鑒別[6]。

1.3 生物效價測定法

生物效價測定(estimation of biological potency)法就是測定藥物對生物機(jī)體某方面作用的強(qiáng)度。如黃柏、黃連、黃芩等具清熱功效中藥的抑菌率或抗菌效價(titer)的測定，對洋地黃強(qiáng)心指標(biāo)生物效價的測定等。生物效價測定法是利用生物體的反應(yīng)來鑒定中藥有效成分的含量或效價，測定藥物的療效和毒性(toxicity)的方法。有些中藥，如洋地黃及其制劑，鈴蘭毒苷及其注射液，到目前為止還沒有找到一種比較合適的化學(xué)分析方法來確定它們的有效成分含量或效價。所以，就宜用生物檢定法進(jìn)行效價測定。生物效價測定的主要原則是將供試品與對照品(包括中藥、純成分)在嚴(yán)格規(guī)定的條件下，比較它們對生物體所產(chǎn)生的反應(yīng)強(qiáng)度，再計算出中藥或其制劑的劑量標(biāo)準(zhǔn)。中藥的效價通常以1g中藥中所具有的“作用單位”數(shù)來表示。這種單位是指在一定條件下所表現(xiàn)一定生理作用的最小劑量。例如，2010年版《中國藥典》規(guī)定洋地黃制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]：洋地黃葉(Folium Digitalis)要保證同樣洋地黃制劑的各種商品的效價一致，而并不是為了使不同的精制強(qiáng)心苷效價相等。因為這種方法不能把它在腸內(nèi)吸收的差別，作用的快慢以及效力的久暫等估計在內(nèi)。鑒于現(xiàn)尚缺乏可靠的定量法，故可利用動物試驗以檢定藥物的效力。此種生物檢定法包括蛙法，貓法，豚鼠法及鴿法等。王盛民等[8]以穿心蓮對照藥材為標(biāo)準(zhǔn)品對穿心蓮藥材和含穿心蓮的中成藥進(jìn)行生物檢定，為其質(zhì)控方法進(jìn)行了生物檢定法研究，方法可行。

1.4 純指標(biāo)測定法

單純指標(biāo)測定法就是測定某藥物或某類藥物某一特性或某一藥理作用的強(qiáng)弱。如對含皂苷類中藥溶血指數(shù)的測定，如使用溶血法鑒定柴胡和大葉柴胡[9]；對含苦味中藥苦味指數(shù)的測定；對含蒽醌類大黃的瀉下作用的測定；對青黛中靛玉紅，兩頭尖中竹節(jié)香附素A的抗癌活性的測定；黃芪中黃芪皂苷甲，三七中三七皂苷降血壓和擴(kuò)張血管作用的測定；對人參中人參多糖，刺五加根中刺五加多糖和紅花多糖的免疫作用的測定；對三七抗凝血作用的測定等。

1.5 DNA遺傳標(biāo)記鑒定法

DNA分子是由G、A、C、T 4種堿基(base pairs)構(gòu)成，為雙螺旋結(jié)構(gòu)的長鏈分子，生物體特定的遺傳信息便包含在特定的堿基排列序列中，遺傳上的差異便表現(xiàn)在4種堿基排列順序的變化之中，這就是生物的遺傳多樣性。比較物種間DNA分子的遺傳多樣性的差異來鑒別物種就是DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別。在DNA分子上，有編碼與物種密切相關(guān)的基因區(qū)域，不十分密切相關(guān)的基因區(qū)域和非編碼基因區(qū)域。DNA遺傳標(biāo)記：這些基因區(qū)域在生物進(jìn)化過程中所受的壓力不同，前者所受選擇壓力大，表現(xiàn)出高度的保守性；后者所受選擇壓力小，表現(xiàn)出較大的差異性。正是這種壓力的不同，使得DNA分子的不同區(qū)域有不同程度的遺傳多樣性。因此可以選擇適當(dāng)?shù)腄NA分子遺傳標(biāo)記，在科，屬，種，亞種，居群和個體上對研究對象進(jìn)行鑒別。

DNA遺傳標(biāo)記鑒定中藥的主要方法：DNA序列測定法，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA指紋分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)，任意引物PCR反應(yīng)技術(shù)(arbitrarily primed PCR，AP-PCR)，限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，PCR擴(kuò)增特定片斷的限制性位點分析等方法[10～11]。黃豐等[12]對西紅花及其5種偽品進(jìn)行鑒定，并證明 RAPD對于應(yīng)用在干燥的植物類生藥的鑒定上有實際應(yīng)用價值。張西玲等[13]利用特異性引物對當(dāng)歸、大黃種子中rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行套式 PCR擴(kuò)增，并將其堿基序列測定，結(jié)果顯示當(dāng)歸、大黃種子 rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的堿基序列具有明顯的差異和可對比性 ，不同植物中藥材種子 rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)堿基序列可作為從分子水平進(jìn)行鑒定的標(biāo)記。劉中權(quán)等[14]采用根據(jù)22種亞洲產(chǎn)龜類的線粒12SrRNA基因片段序列，設(shè)計一對專用于鑒定中藥材龜甲原動物龜?shù)蔫b別引物，用該對引物擴(kuò)增從烏龜和其他 18種龜48個樣品的 DNA模板。結(jié)果：在 72℃的復(fù)性溫度下進(jìn)PCR，4個烏龜?shù)哪０?DNA均得到約180bp的陽性擴(kuò)增而其他各龜?shù)哪０錎NA，在同樣條件下無擴(kuò)增產(chǎn)物。用對鑒別引物經(jīng)1次 PCR反應(yīng)便可準(zhǔn)確地鑒定受試原動是否為烏龜。Fushimi等[15]采用PCR2RFLP方法對人參屬3種植物人參、西洋參和竹節(jié)參進(jìn)行了核基因組18S-rRNA片段分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ban和Dde I酶解的指紋圖譜較易將其區(qū)別開來。

1.6 mRNA差異顯示鑒定法

mRNA差異顯示鑒定法是利用中藥不同組織或細(xì)胞在基因表達(dá)(gene expression)上的差異進(jìn)行鑒定的一種方法。它通過將總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA(complementary DNA)，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，分離出不同分子大小的DNA，挑選出有差異的表達(dá)基因進(jìn)行序列分析。既可以制備探針用于穩(wěn)定靈敏的檢測實驗，也可以制備其蛋白產(chǎn)物及其抗體進(jìn)行免疫檢測。采用該技術(shù)，可以提煉出栽培和野生，道地和普通藥材等之間的特征，可望廣泛用于中藥的品種和質(zhì)量鑒定[10～16]。

2 討論

中藥生物鑒定法側(cè)重中藥的品質(zhì)和臨床用藥的安全性、有效性等的有機(jī)結(jié)合的研究，可以配合其他鑒定方法綜合解決中藥品質(zhì)鑒定的難題，并嘗試為中醫(yī)與中藥現(xiàn)代化的結(jié)合找到突破口。

中藥的品種鑒定和質(zhì)量控制是中醫(yī)藥研究的基礎(chǔ)，選擇最佳的方法、手段鑒定和評價中藥是新藥開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。生物鑒定法目前在中藥鑒定領(lǐng)域已有很大的應(yīng)用，但目前此方法尚處于起步階段，在具體實施中相關(guān)方法和技術(shù)還有待于進(jìn)一步完善。但我們相信這種方法在不久的將來一定會成為鑒定和評價中藥的重要手段。

[1]張貫君,李曉波.常用中藥生物鑒定[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

[2]籍承厚.中藥鑒定方法的新進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,7 (4):21.

[3]楊洪鳴,李真玉,唐金寶.現(xiàn)代生物技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].中國藥師,2004,7(10):811.

[4]向金蓮,張榕.現(xiàn)代分析技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].華西藥學(xué)雜志,2001,16(3):204.

[5]曹璽.淺談中藥鑒定技術(shù)的進(jìn)展.云南中醫(yī)中藥雜志[J].2004,25(5):36.

[6]陳月娥,姚小華.中藥鑒定新技術(shù)的發(fā)展概況[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,24(4):347.

[7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[8]王盛民,張瑛,趙子劍,等.清熱解毒類中藥的生物鑒定法Ⅲ-穿心蓮的生物鑒定[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2006,10(3):27.

[9]劉萍,張雅芳.溶血法鑒別柴胡與大葉柴胡[J].中成藥,1995,17(3):25.

[10]方和桂.基因技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].中草藥,2006,37(2):316.

[11]徐敏,熊耀康.DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,26(10) .

[12]黃豐,王培訓(xùn).西紅花的RAPD鑒別研究[J].中藥新藥與臨床藥理,1999,10(4):226.

[13]張西玲,姬可平,李應(yīng)東,等.DNA測序建立甘肅當(dāng)歸、大黃種子rRNA基因圖譜的研究[J].中藥材,2003,26 (7):481.

[14]劉中權(quán),王義權(quán),周開亞,等.中藥材龜甲及原動物的高特異性PCR鑒定研究[J].藥學(xué)學(xué)報,1999,34(12):941.

[15]Fushimi H,Komatsu K,Isobe M,et al.Application of PCR2RFLPand MASA analyse on 18S ribosomal RNA gene sequence for the identification of three ginseng drugs[J].Biol Pharm Bull,1997(20):765.

[16]李世和.中藥材質(zhì)量鑒定新方法的探討[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,1998,18(7):311.