閆廷贊，黃建安

(1.常州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇常州213000;2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇蘇州215000)

惡性胸腔積液是惡性腫瘤胸膜轉(zhuǎn)移引起的，形成機制主要為胸膜通透性的增高和淋巴回流障礙。肺癌是最常見的病因，惡性胸腔積液的出現(xiàn)提示惡性腫瘤患者病程進展至晚期，預(yù)后差。但胸腔積液中含有豐富的免疫活性細胞，其有可能應(yīng)用于腫瘤的免疫治療。

樹突狀細胞(dendritic cell，DCs)是體內(nèi)最有效的抗原遞呈細胞，可以激活初始免疫應(yīng)答，在機體免疫中有重要作用，近年成為腫瘤免疫治療的熱點［1］。本實驗擬從惡性胸腔積液中分離DCs前體，體外誘導(dǎo)為DCs，通過檢測其干擾素 － γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素－10(interleukin-10，IL-10)的表達，評估對淋巴細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 15例惡性胸腔積液標(biāo)本選自我院收治的晚期肺癌患者，均經(jīng)手術(shù)、纖維支氣管鏡等病理確診，其中肺腺癌9例，鱗癌4例，小細胞癌2例。

1.2 DCs的誘導(dǎo)培養(yǎng) 常規(guī)胸腔穿刺獲取惡性胸腔積液標(biāo)本200～500 mL，加入肝素10 IU·mL－1抗凝，離心獲取細胞沉渣，以Hanks液混懸細胞。在離心管中依次加入100%Ficoll、75%Ficoll(以含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640配制)及細胞懸液，使之形成3層具有2個清晰界面的液體，2 000 r·min－1離心30 min后，收集100%及75%Ficoll層間的細胞，洗滌后以含10%FCS的RPMI-1640調(diào)整細胞濃度為3～5×106mL－1，加入 6 孔板中(每孔 2 mL)，體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，輕輕吹打吸出懸浮細胞，貼壁細胞以 GM-CSF(100 mg·L－1)、IL-4(20 mg·L－1)、體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)6 d，再加入 TNF-α(20 mg·L－1)繼續(xù)培養(yǎng)3 d。

1.3 DCs的表型分析 收集惡性胸腔積液培養(yǎng)6、9 d DCs孔中懸浮及半懸浮細胞，PBS洗滌后分至試管中，每管約2×105，分別加入PE標(biāo)記的鼠抗人HLADR、CD83單克隆抗體各10 μL，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD1a單克隆抗體20 μL，并以相應(yīng)標(biāo)記的小鼠同型IgG抗體作對照，4℃冰箱中避光孵育30 min，PBS洗滌后流式細胞儀分析表型。

1.4 IL-10和IFN-γ含量的檢測 收集惡性胸腔積液中培養(yǎng)6、9 d的 DC上清，按晶美生物工程公司ELISA試劑盒說明書分別檢測IL-10和IFN-γ的含量。

1.5 主要試劑 胎牛血清(杭州四季青公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基 (美國Sigma公司)，人重組GM-CSF(廈門特寶生物工程公司)，人重組IL-4(北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué) T細胞實驗室)，人重組 TNF-α(美國 R＆D公司)，PE標(biāo)記的鼠抗人CD83、HLA-DR及FITC標(biāo)記的鼠抗人CD1a單克隆抗體(法國Immunotech公司);人IFN-γ ELISA試劑盒、人IL-10 ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用±s表示，比較采用配對t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 DCs形態(tài)的觀察 培養(yǎng)2 d后倒置顯微鏡下觀察，細胞聚集成小的集落，并有少量細胞懸浮，5～6 d后懸浮細胞明顯增多，邊緣形成明顯毛刺狀突起，培養(yǎng)8～9 d，可見細胞體積增大伸長，毛刺多而密，呈典型的DCs形態(tài)。

2.2 DCs表型 惡性胸腔積液中誘導(dǎo)培養(yǎng)9 d的DCs，高表達 MHCⅡ類分子 HLA-DR(93.4 ±3.1)%及人類DCs相對特異性分子CD83(53.8 ±11.3)%和CD1a(41.4 ±18.4)%，均明顯高于誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d的 DCs，分別為 HLA-DR(70.9 ±4.2)%、CD83(38.6±19.3)%、CD1a(24.9 ±11.1)%，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 DCs培養(yǎng)上清中IL-10和IFN-γ含量 培養(yǎng)6 d的DCs上清中 IL-10和 IFN-γ含量分別為(649.9±316.7)ng·L－1和(21.6 ± 14.3)ng·L－1，TNF-α 刺激成熟后 IL-10 含量明顯降低 (455.7 ±229.6)ng·L－1，IFN-γ含量則明顯升高 (49.6 ±15.9)ng·L－1，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

DCs因其成熟時有許多樹突狀突起而得名，未成熟期有較強的抗原吞噬和加工處理能力，但抗原遞呈功能弱，接受抗原刺激后逐漸成熟，高表達共刺激分子和MHC分子，具有較強的抗原遞呈功能，可刺激T淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。本實驗通過貼壁法分離惡性胸腔積液中DCs前體后，體外以GM-CSF、IL-4和TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得了典型樹突狀形態(tài)的DCs，TNF-α刺激后高表達MHCⅡ類分子HLA-DR，以及人類DCs相對特異性標(biāo)志CD83和CD1a。CD83是DCs成熟的標(biāo)志，MHC分子和共刺激分子在抗原遞呈過程中分別提供第1信號和第2信號，是DCs識別、攝取抗原以及與其他免疫細胞間信號傳遞的必要條件，最能反映DCs的免疫功能。說明肺癌惡性胸腔積液中DCs前體可以體外誘導(dǎo)為正常形態(tài)、表型的成熟DCs，與鐘華等［2］的研究結(jié)論是一致的。

惡性胸腔積液中淋巴細胞約占有核細胞的50%～70%，其中絕大部分為T淋巴細胞，B淋巴細胞較少。而其中又以CD4+T細胞為多，約占淋巴細胞數(shù)量的70%左右，CD8+T細胞次之。CD4+Th細胞根據(jù)其分泌的細胞因子的不同，可將其分為Th0、Th1和Th2細胞3種亞型。Th0細胞受不同的細胞因子刺激后，分別向Th1和Th2細胞分化。IL-2、IL-12和IFN-γ可促使Th0細胞向Th1細胞分化，Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ，與細胞毒性T淋巴細胞的增殖、分化、成熟有關(guān)，主要促進細胞免疫應(yīng)答。而IL-4、IL-10等則促使Th0細胞向Th2細胞分化，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子，與B淋巴細胞的增殖、成熟有關(guān)，因此Th2細胞主要增強體液免疫應(yīng)答。

惡性胸腔積液中 IFN-γ、IL-12含量較低，而 IL-4水平相對較高［3］，說明惡性胸腔積液中的淋巴細胞Th1/Th2失衡，Th2占優(yōu)勢，Th2細胞主要和體液免疫有關(guān)，而抗腫瘤免疫是以細胞免疫為主，提示其中的淋巴細胞抗腫瘤活性是受到抑制的。而惡性腫瘤微環(huán)境中的DCs同樣難以發(fā)揮有效的抗原遞呈作用［4］。但惡性胸腔積液中的DCs前體在體外培養(yǎng)成熟后，具有較強的刺激同源腫瘤浸潤淋巴細胞增殖的能力［5］。

Decker等［6］的研究證明正常人外周血來源 DCs具有TH1極性，而本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中的DCs體外培養(yǎng)成熟后Th1型細胞因子IFN-γ分泌明顯增高，Th2型細胞因子IL-10明顯降低，也能促進Th1反應(yīng)。因此，惡性胸腔積液來源的DCs不僅可以刺激淋巴細胞增殖，還可以通過細胞因子的分泌促進淋巴細胞分化，具有免疫治療的潛能。

［1］Sabado RL，Bhardwaj N.Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment［J］.Immunotherapy，2010，2(1):37－56.

［2］鐘華，韓寶惠，董強剛，等.肺癌胸腔積液中樹突狀細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及功能分析［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27(8):542－545.

［3］Okamoto M，Hasegawa Y，Hara T，et al.T-helper type 1/T-helper type 2 balance in malignant pleural effusions compared to tuberculous pleural effusions［J］.Chest，2005，128(6):4030 － 4035.

［4］Ma Y，Aymeric L，Locher C，et al.The dendritic cell-tumor crosstalk in cancer［J］.Curr Opin Immunol，2011，23(1):146 －152.

［5］黃慧，曾波航，陳靜琦.從惡性胸腔積液體外誘導(dǎo)成熟樹突細胞［J］.癌癥，2005，24(6):663 －666.

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