李宗泰，張 灝

外周血游離DNA甲基化檢測(cè):食管鱗癌早期診療的新機(jī)遇

李宗泰，張 灝

癌組織DNA甲基化作為一種典型的至關(guān)重要的表觀遺傳事件，已被證實(shí)在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近年關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌患者外周血與配對(duì)癌組織進(jìn)行的DNA甲基化研究已初步證明兩者有較好的一致性，且相比較手術(shù)或活檢獲得的腫瘤組織檢測(cè)，外周血游離DNA甲基化檢測(cè)有著無(wú)創(chuàng)以及可隨時(shí)重復(fù)取材的優(yōu)勢(shì)，有望成為食管鱗狀細(xì)胞癌早期篩查診斷及治療后動(dòng)態(tài)預(yù)警復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的有力手段。另外，研究顯示外周血游離DNA甲基化是一類(lèi)可預(yù)測(cè)腫瘤治療敏感性的潛在標(biāo)志物，為滯后的食管鱗狀細(xì)胞癌個(gè)體化治療提供新思路。

食管鱗狀細(xì)胞癌;外周血;脫氧核糖核酸甲基化

食管癌是全球腫瘤致死的第六大病因，其總的5年生存率不足17%;而中國(guó)食管癌的發(fā)病率和病死率均居世界之首，其中90%是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［1-2］。由于早期非特異癥狀常被忽視，大部分ESCC患者確診時(shí)已是中晚期，往往難以通過(guò)組織標(biāo)本進(jìn)行早期診斷。與中晚期食管鱗癌不同，早期食管鱗癌5年生存率＞90%［3］?，F(xiàn)行臨床ESCC診斷方法如X線食管鋇餐造影等，不但很可能遺漏早期病變或小病灶，而且不便于大范圍篩查，預(yù)后判斷和隨診復(fù)查亦缺乏理想的特異性方法。另外，目前臨床ESCC個(gè)體化治療相對(duì)滯后，尚無(wú)方便、可靠用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的分子標(biāo)志物。

研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤患者外周血游離DNA(又稱(chēng)循環(huán)DNA或無(wú)細(xì)胞DNA，包括血漿DNA或血清DNA等)與正常人相比有巨大差異，且其比外周血中蛋白質(zhì)、RNA相對(duì)更穩(wěn)定。而且，抑癌基因的DNA甲基化是ESCC的重要癌變機(jī)制。近年有關(guān)外周血DNA甲基化在ESCC早期篩查診斷和及早預(yù)警、干預(yù)ESCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的研究取得較多進(jìn)展，其方便、快捷、特異、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的優(yōu)點(diǎn)和巨大潛在臨床價(jià)值格外引人關(guān)注。本文結(jié)合臨床實(shí)際和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)其作一綜述。

1 外周血游離DNA甲基化在ESCC中的生物學(xué)意義

多年前已有研究表明腫瘤患者血清DNA含量明顯高于正常人［2］。Stroun等［4］首先發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中游離DNA的主要來(lái)源之一是腫瘤細(xì)胞DNA，其具有某些與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相同的分子生物學(xué)特性。后來(lái)的研究支持了Stroun的觀點(diǎn)，外周血游離DNA可檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的基因突變，且該變異與原發(fā)腫瘤基本一致［5］。他們均提示外周血游離DNA甲基化與腫瘤性質(zhì)有良好的相關(guān)性，可充當(dāng)潛在的實(shí)時(shí)腫瘤標(biāo)本。

腫瘤基因表達(dá)改變主要通過(guò)兩大機(jī)制:遺傳學(xué)機(jī)制和表觀遺傳學(xué)機(jī)制。在多種腫瘤組織中的研究已提示，作為表觀遺傳學(xué)主要形式之一的DNA富CpG島的啟動(dòng)子過(guò)甲基化不但是癌變過(guò)程中的常見(jiàn)早期事件，而且他與病灶發(fā)展有關(guān)。在組織或細(xì)胞標(biāo)本中也證實(shí)DNA甲基化可能參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展［6-7］，有助于早期篩查、診斷［8-9］，并且與ESCC的淋巴轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)［10-11］。而另一些研究提示外周血游離DNA甲基化與腫瘤組織DNA甲基化改變具有較高的一致性［12-13］。

2 外周血游離DNA高甲基化與ESCC

近年研究通過(guò)分析ESCC患者外周血游離DNA以及配對(duì)組織DNA中多種抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)外周血游離DNA高甲基化是ESCC特異性的早診、預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物，為發(fā)展臨床診療新策略提供理論基礎(chǔ)。

2.1 抑癌基因p16(p16-INK4A，p16) 在細(xì)胞增殖的調(diào)控中，p16蛋白與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)與CDK4/CDK6的結(jié)合，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。文獻(xiàn)報(bào)道ESCC高危區(qū)中ESCC組織、高級(jí)上皮內(nèi)瘤變組織(包括原位癌)的高甲基化頻率顯著高于慢性食管炎組織(依次分別為P=0.003，P=0.000)［14］，這為 ESCC形成的早期已存在P16異常甲基化提供了直接證據(jù)。早期研究發(fā)現(xiàn)ESCC組織及其配對(duì)血清均存在p16啟動(dòng)區(qū)高甲基化(頻率依次為81.6%和18.4%)［15］，但另一項(xiàng)研究中p16啟動(dòng)區(qū)甲基化檢出率較低(ESCC組織為20%，術(shù)前血清為5.3%)［16］。伊朗東北部一個(gè) ESCC高危家族中64.3%的成員檢出外周血p16啟動(dòng)區(qū)異常甲基化，其中伴有類(lèi)似食管癌癥狀但內(nèi)鏡檢查陰性者的高甲基化率高達(dá)80%;同地區(qū)的散發(fā)ESCC患者癌組織、血清和外周血的p16甲基化頻率分別為73.3%、26.6%和43.3%，且在Ⅱ、Ⅲ期腫瘤中頻率更高;而其他地區(qū)的健康志愿者的血樣本中均未出現(xiàn)高甲基化［17］，這提示外周血游離p16甲基化不僅可能更早地提供預(yù)警信號(hào)，并且可能還在一定程度上解釋高危地區(qū)ESCC家族聚集的分布特性。重要的是，在食管癌前病變患者的所有血樣本中，慢性食管炎及低級(jí)上皮內(nèi)瘤變中未見(jiàn)p16甲基化，而高級(jí)上皮內(nèi)瘤變和ESCC p16甲基化頻率依次為8.69%和32.43%，提示p16甲基化水平隨食管疾病的發(fā)展而增長(zhǎng)，且可能只有當(dāng)病變發(fā)展至高級(jí)上皮內(nèi)瘤變時(shí)才能在血漿中被檢出［14］，這進(jìn)一步證明了血漿P16異常甲基化可以協(xié)助臨床早期發(fā)現(xiàn)ESCC。

2.2 脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，

FHIT)FHIT是一種抑癌基因，在和環(huán)境致癌因素密切相關(guān)的腫瘤表達(dá)明顯降低。其啟動(dòng)區(qū)過(guò)甲基化導(dǎo)致其蛋白表達(dá)的改變?cè)谑彻馨┑陌l(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。類(lèi)似的觀點(diǎn)已在外周血、組織標(biāo)本的配對(duì)研究中得到驗(yàn)證，且外周血游離FHIT甲基化可能有利于高發(fā)地區(qū)ESCC的早期篩查。該研究中高危地區(qū)的食管癌前病變組織和ESCC組織FHIT甲基化發(fā)生率分別是35.29%和67.57%。配對(duì)的外周血游離FHIT甲基化檢出率隨疾病的發(fā)展而增加:慢性食管炎和低度上皮內(nèi)瘤變均為0%，而高度上皮內(nèi)瘤變和ESCC分別為8.70%和37.84%［18］。此研究為進(jìn)一步探索ESCC與食管癌前病變、食管炎在外周血游離DNA甲基化的不同機(jī)制提供了直接依據(jù)。

2.3 O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) MGMT 是一種高效的DNA直接修復(fù)酶，可修復(fù)由烷化劑引起的DNA損傷，因而在DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用。江蘇淮安的91例新診斷ESCC的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中MGMT的甲基化頻率明顯高于癌旁組織(P＜0.01)，說(shuō)明其異常甲基化可增加ESCC患病風(fēng)險(xiǎn)(比值比 OR=7.750，95%可信區(qū)間 CI:2.736～21.955)。同時(shí)，其在血漿與癌組織之間具有顯著相關(guān)性(Kappa=0.603，P＜0.01)，提示血漿游離MGMT啟動(dòng)子甲基化可為ESCC的篩查、早期診斷及預(yù)后判斷提供有價(jià)值的信息［15］。關(guān)于MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致其mRNA轉(zhuǎn)錄障礙的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

2.4 Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(ras-association domain family 1 A，RASSF1A) RASSF1A作為一種新型抑癌基因，在腫瘤中表達(dá)失活主要是由于啟動(dòng)子CpG島的特異性高甲基化。中國(guó)高發(fā)區(qū)的30例ESCC患者的研究中，癌旁正常食管組織RASSF1A甲基化率為13%，明顯低于癌組織中40%(P＜0.05);而其在外周血中為23.3%，與癌組織的甲基化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但同一個(gè)體的癌組織和外周血陽(yáng)性一致率達(dá)58%，陰性率完全一致，提示外周血游離RASSF1A甲基化可以反映同一個(gè)體組織中RASSF1A基因甲基化的狀態(tài)，因而可能是ESCC高危人群篩查重要候選分子標(biāo)志之一。另外，外周血甲基化陽(yáng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)［17］。

2.5 Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)RUNX3是一種腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中表達(dá)沉默。一項(xiàng)研究顯示，ESCC組織RUNX3啟動(dòng)子甲基化頻率為64.3%(27/42)，對(duì)應(yīng)的相鄰正常組織均為0%;RUNX3啟動(dòng)子甲基化與患者臨床分期相關(guān)，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織檢出率(83.3%)顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(38.9%)(P=0.003)［14］。目前只有國(guó)內(nèi)報(bào)道外周血中游離RUNX3甲基化在ESCC的研究，ESCC患者血清RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化檢出率為51.4%(n=70)，健康志愿者均為0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，提示其可成為早期診斷的分子標(biāo)志物。同時(shí)，Ⅲ、Ⅳ期患者癌組織RUNX3基因異常甲基化發(fā)生率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(P=0.027)，且伴淋巴轉(zhuǎn)移者的過(guò)甲基化頻率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.032)，但對(duì)應(yīng)的外周血游離RUNX3甲基化與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，這可能與Ⅳ期樣本較少有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究［16］。

2.6 錯(cuò)配修復(fù)基因1(human mutL homolog 1，hMLH1)hMLH1表達(dá)上調(diào)或下調(diào)啟動(dòng)子甲基化可能是其表達(dá)沉默的重要原因之一，從而導(dǎo)致DNA錯(cuò)配修復(fù)能力低下、癌癥風(fēng)險(xiǎn)增高。一項(xiàng)包含47例ESCC的良惡性食管疾病對(duì)照研究(n=124)發(fā)現(xiàn)，盡管食管炎與內(nèi)鏡下正常食管組織間hMLH1甲基化狀態(tài)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但癌和癌前病變組織的hMLH1高甲基化率則較前兩者顯著增加(P＜0.01)［19］。這說(shuō)明其異常甲基化可增加食管磷癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。然而，該研究中僅14.5%的組織和外周血能同時(shí)測(cè)到hMLH1過(guò)甲基化，且外周血與組織間該基因甲基化無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(r=0.26，95%CI 0.09～0.41)［19］。當(dāng)然，這也可能是樣本量不足等因素引起的，故需要更大規(guī)模的研究來(lái)證實(shí)血中游離該基因的異常甲基化能否協(xié)助ESCC的早期診斷。

2.7 腺瘤性結(jié)腸息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)及死亡相關(guān)蛋白激酶(death associated protein kinase，DAPK)APC是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的抑癌基因，參與修復(fù)細(xì)胞DNA。一項(xiàng)包括ESCC、腺癌的研究提及癌組織APC啟動(dòng)子過(guò)甲基化頻率為50%(16/32)，血漿為6.3%(2/32)。但此研究主要集中于食管腺癌，并未深入探求外周血甲基化與ESCC的關(guān)系［20］。DAPK是一種負(fù)責(zé)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的蛋白激酶，對(duì)防止腫瘤的發(fā)生及遏制腫瘤的發(fā)展具有重要意義。一項(xiàng)研究(35例食管腺癌，24例ESCC)發(fā)現(xiàn)術(shù)前聯(lián)合外周血游離DAPK、APC啟動(dòng)子甲基化有助于更好地估計(jì)食管癌患者術(shù)后的生存概率，其中APC甲基化可能作為術(shù)后檢測(cè)腫瘤是否明顯殘留的標(biāo)志物(P=0.03)［21］。當(dāng)然，該研究以食管腺癌為主，其結(jié)論尚需進(jìn)一步研究來(lái)印證，例如增加ESCC樣本、補(bǔ)充相應(yīng)組織以及正常人血標(biāo)本的對(duì)比檢測(cè)。

2.8 溶質(zhì)載體家族5成員8基因(solute carrier family 5 member 8，SLC5A8)SLC5A8是一種新的候選腫瘤抑制基因，在人類(lèi)的結(jié)腸癌、胃癌中表達(dá)降低或缺失。雖然在多種腫瘤中可檢測(cè)其啟動(dòng)子高甲基化，但在國(guó)外至今仍無(wú)報(bào)道SLC5A8基因甲基化與ESCC的關(guān)系。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)45例食管癌癌組織(其中34例鱗癌，11例腺癌)的研究發(fā)現(xiàn)癌組織SLC5A8基因甲基化頻率(68．8%)顯著高于相應(yīng)的癌旁(11.1%)及切緣組織(4.4%)，P＜0.01;其中30例患者術(shù)前血漿該基因過(guò)甲基化檢出率(43.3%)顯著高于對(duì)應(yīng)的術(shù)后血漿(16.7%)，P＜0.05。同時(shí)，所有組織甲基化陰性者的外周血甲基化也均為陰性［22］。該研究提示它是食管癌發(fā)生的重要早期分子事件之一，血漿中SLC5A8基因甲基化檢測(cè)可作為術(shù)前診斷的重要參考指標(biāo)。但這種血漿甲基化狀態(tài)的變化是否與食管癌的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸存在關(guān)系，以及化放療是否也可改變血漿游離DNA甲基化狀態(tài)，這些均尚未清楚。

2.9 受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O(protein tyrosine phosphatase receptor-type O，PTPRO) PTPRO 是新近發(fā)現(xiàn)的受體型蛋白酪氨酸磷酸酶。我們實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)ESCC患者外周血樣本PTPRO基因過(guò)甲基化僅存在腫瘤組織同樣過(guò)甲基化的病例(20/36，55.6%)，但尚未發(fā)現(xiàn)其與ESCC分化程度、浸潤(rùn)深度、腫瘤臨床分期存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)(P＞0.05)［23］，這也提示我們需要增加樣本和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 外周血游離DNA甲基化與藥物敏感性:ESCC個(gè)體化治療的機(jī)遇

很多病例即使從現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)判斷預(yù)后較好，但治療后仍發(fā)生復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等不良事件，不同患者采用相同化療方案所取得的療效卻存在巨大差異。而且已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性、治療的作用可能導(dǎo)致腫瘤的基因表達(dá)或突變發(fā)生改變，繼而改變腫瘤對(duì)藥物的敏感性［24］。另一方面，在腫瘤中基因啟動(dòng)區(qū)高甲基化事件發(fā)生頻率比基因突變更高［25］，這提示在反映腫瘤基因改變時(shí)DNA甲基化比突變更敏感。

目前臨床最快也要化療2周期后通過(guò)影像學(xué)、查體等檢查才能確定療效，這種相對(duì)滯后性無(wú)疑增加了ESCC患者不必要的化療負(fù)荷，更耽誤了及早控制病灶的寶貴時(shí)機(jī)。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的性質(zhì)(基因)并預(yù)測(cè)ESCC的治療反應(yīng)有可能真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化合理用藥并獲取最大臨床效益。但臨床常規(guī)的組織病理檢查，常常因其量少僅能滿足確診，而難以多次重復(fù)取材以滿足檢測(cè)ESCC腫瘤性質(zhì)的變化。

p16、RUNX-3、MGMT基因DNA啟動(dòng)區(qū)甲基化水平及發(fā)生率在放化療敏感的食管癌患者癌組織中均明顯低于不敏感的患者癌組織(P=0.003)［26］。更有啟發(fā)意義的是，有研究表明BRCA1基因甲基化可預(yù)測(cè)卵巢癌以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療反應(yīng)，而ESCC的化療亦以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)［27］;外周血游離 RASSF1A基因DNA甲基化狀態(tài)變化可能用于判斷乳腺癌術(shù)后他莫昔芬治療的敏感性［28］;外周血游離14-3-3-σ基因DNA啟動(dòng)區(qū)甲基化變化的不同模式可能預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療反應(yīng)［29］。盡管尚未有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于外周血游離DNA甲基化指導(dǎo)ESCC個(gè)體化用藥的研究，但上述資料提示外周血游離DNA甲基化很可能作為監(jiān)測(cè)ESCC腫瘤性質(zhì)變化以及預(yù)測(cè)抗癌藥物治療敏感性的分子標(biāo)志物，進(jìn)而成為篩選治療優(yōu)勢(shì)人群并成為指導(dǎo)ESCC個(gè)體化治療的新手段。

4 結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)外臨床尚無(wú)成熟可靠的ESCC分子生物標(biāo)志物，而無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便并可隨時(shí)實(shí)施的外周血游離DNA甲基化檢測(cè)，不再受腫瘤組織取材不便的限制，對(duì)ESCC早期診斷、預(yù)警轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及隨訪均已顯示出巨大的積極意義。由于報(bào)道的相關(guān)基因有限，將其應(yīng)用于臨床還有待開(kāi)展更多大樣本量的腫瘤相關(guān)基因的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。另外，相關(guān)研究仍偏少，且局限在早期診斷和預(yù)后，而至今仍無(wú)外周血游離DNA甲基化與ESCC個(gè)體化治療的研究。鑒于外周血游離DNA甲基化已被證明可在不少腫瘤中預(yù)測(cè)抗癌藥物治療反應(yīng)，以便避免盲目用藥和減少放化療的不良反應(yīng)，這對(duì)缺少組織標(biāo)本的ESCC患者更為重要。所以，利用其進(jìn)行分子檢測(cè)和基因分型無(wú)疑代表了ESCC個(gè)體化治療研究的新方向。再者，未來(lái)研究不僅需要建立敏感性、特異性良好的ESCC甲基化圖譜，還應(yīng)著眼于進(jìn)一步闡明ESCC發(fā)生、發(fā)展的具體DNA甲基化機(jī)制，最終將外周血游離DNA甲基化檢測(cè)轉(zhuǎn)化于臨床，使ESCC患者獲益。

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R735.1

A

2095-3097(2012)01-0044-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.012

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81071736，30973508)

515041廣東汕頭，汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(李宗泰，張 灝)

張 灝，E-mail:haozhang@stu.edu.cn

2012-05-06 本文編輯:徐海琴)