齊志國(guó) 張鐵鷹 董杰麗 杜家菊

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255049)

羽毛和羊毛是自然界中最主要的角蛋白資源，然而其內(nèi)部含硫氨基酸豐富，二硫鍵多，致使結(jié)構(gòu)極穩(wěn)定。傳統(tǒng)物理化學(xué)處理角蛋白的方法存在諸多不足，而利用微生物和酶等生物學(xué)方法處理角蛋白，條件溫和、污染小、氨基酸破壞低，對(duì)合理利用角蛋白資源和緩解蛋白資源短缺具有現(xiàn)實(shí)意義。細(xì)菌、真菌、放線菌等多種微生物可降解角蛋白，其破壞角蛋白二硫鍵的假說(shuō)較多，主要包括硫解理論[1]、物理壓力理論[2]和酶解理論[3]等。近年來(lái)，二硫鍵還原酶在角蛋白降解中的作用日益受到關(guān)注。Yamamura等[4]于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌發(fā)酵液中分離出了二硫鍵還原酶和蛋白水解酶，并證實(shí)二硫鍵還原酶對(duì)角蛋白的降解具有較強(qiáng)促進(jìn)作用。Prakash 等[5]、Ramnani等[6]和 Ghosh 等[7]亦先后在水解角蛋白的微生物發(fā)酵液中檢測(cè)到了二硫鍵還原酶，進(jìn)一步證實(shí)了二硫鍵還原酶在微生物降解角蛋白中的關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選獲得高效羽毛角蛋白降解菌,對(duì)其胞內(nèi)與胞外酶活組成、發(fā)酵液中含硫離子、巰基和可溶性蛋白含量測(cè)定分析,探討其降解羽毛角蛋白的機(jī)制，為提高其對(duì)角蛋白生物降解提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 羽毛粉的制備和培養(yǎng)基

分別將雞羽毛和羊毛用洗滌劑揉搓洗凈，121℃高壓滅菌1 h，再用清水洗凈，然后80℃烘48 h，冷卻后粉碎過(guò)100目篩，用于培養(yǎng)基制備和微生物發(fā)酵。

選擇培養(yǎng)基：羽毛粉 10 g、瓊脂 20 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、KH2PO40.4 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值 7.4～7.6，121℃滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 0.5 g、K2HPO41 g、KH2PO40.4 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值7.4～7.6，121℃滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：羽毛粉 10 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.7 g、KH2PO40.35 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的分離篩選、鑒定

1.2.1 菌株的分離篩選

采集腐爛羽毛及其周?chē)寥溃Q(chēng)取適當(dāng)樣品，將其梯度稀釋后涂布于以羽毛粉為唯一碳氮源基礎(chǔ)平板上，37℃倒置培養(yǎng)3 d左右，挑取有明顯水解圈的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)和馴化，并保存菌株。將菌株富集培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期種子液（0.6＜OD600＜0.8）接種于僅含有完整羽毛的無(wú)菌生理鹽水中搖瓶發(fā)酵，觀察羽毛降解情況，篩選降解羽毛速度最快菌株。

1.2.2 篩選菌形態(tài)觀察與分子鑒定

取分離的菌株于牛肉膏蛋白胨平板上劃線培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形狀、顏色、光學(xué)特性、表面特性等。之后利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組，運(yùn)用16S rDNA通用引物F27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R1429：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，結(jié)果在NCBI中運(yùn)用Blast進(jìn)行序列同源性搜索，應(yīng)用Clustal X1.83進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA4中Neighbor-joining方法建樹(shù)（Bootstrap重復(fù)數(shù)為 1 000）。

1.3 篩選菌對(duì)羽毛角蛋白的降解與機(jī)制研究

1.3.1 篩選菌發(fā)酵產(chǎn)物分析

取對(duì)數(shù)期（0.6＜OD600＜0.8）微生物種子液接種到50 ml/250 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4%，然后37℃、150 r/min 搖床分別培養(yǎng) 6、12、24、48、72、96 h，實(shí)驗(yàn)處理均為3個(gè)重復(fù)。檢測(cè)上述不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的胞外上清液中角蛋白酶活性、可溶性蛋白與巰基含量，對(duì)菌株CP-7發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.3.2 發(fā)酵上清液中含硫離子檢測(cè)

取發(fā)酵48 h菌株發(fā)酵液，離心制備上清液，檢測(cè)上清液中亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。硫代硫酸鹽采用兩種方法進(jìn)行定性檢測(cè)。一是將上清液酸化至pH值3.0，若出現(xiàn)渾濁則為有硫代硫酸鹽產(chǎn)生；二是觀察上清液中加入FeCl3后是否會(huì)出現(xiàn)紫色。若有紫色出現(xiàn)表明有硫代硫酸鹽產(chǎn)生，反之則無(wú)。亞硫酸鹽則采用BaCl2檢測(cè),若發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生亞硫酸鹽,當(dāng)加入BaCl2溶液后，上清液則出現(xiàn)白色沉淀，且沉淀可以使KMnO4脫色，反之則無(wú)亞硫酸鹽產(chǎn)生。

1.3.3 胞內(nèi)、胞外液酶活性分析

取發(fā)酵48 h菌株發(fā)酵液，制備胞外、胞內(nèi)和混合粗酶液。分別以10mg羽毛、羊毛和酪蛋白為底物，檢測(cè)角蛋白和酪蛋白水解活性。同時(shí)檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間胞內(nèi)、胞外上清液中二硫鍵還原酶活性，探討不同酶液組分在角蛋白降解中的作用。

1.4 酶活性及相關(guān)生化指標(biāo)分析方法

1.4.1 粗酶液制備

發(fā)酵液于 4 ℃、10 000×g離心 10 min，經(jīng) 0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾后即為胞外粗酶液。收集胞體，懸浮于0.05 mol/l pH值10.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，用3倍磷酸鹽緩沖液洗脫3次，然后用1%的溶菌酶溶解1 h，再用超聲波破碎儀冰浴條件下破碎10 min，4℃下10 000×g離心10 min，上清液經(jīng)過(guò)濾后為胞內(nèi)粗酶液。混合酶液通過(guò)1 ml的胞外粗酶液與1 ml胞內(nèi)粗酶液混合得到。

1.4.2 角蛋白酶活性測(cè)定

采用Gradisar[8]所描述的方法為基礎(chǔ)，并加以修改。具體操作步驟:10mg羽毛粉與2.0 ml Tris/HCl（pH值 8.0，濃度0.05 mol/l）緩沖液混合，加入1.0 ml上清液，180 r/min、40℃保溫處理1 h，每隔10 min取出用力震蕩。反應(yīng)結(jié)束時(shí)添加2.0 ml的6%三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，靜止 5 min，10 000×g 離心 15 min，上清液于280 nm下測(cè)定其吸光值，采用保溫前添加TCA的反應(yīng)管作為對(duì)照。酶活定義:pH值8.0、40℃保溫處理1 h后，A280值升高0.01個(gè)單位為1 U。

1.4.3 酪蛋白水解活性測(cè)定

酪蛋白水解活性參照蛋白酶活性（紫外分光光度法）測(cè)定方法。

1.4.4 二硫鍵還原酶活性測(cè)定

二硫鍵還原酶活性結(jié)合Ellman[9]和Brown[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。1 ml由粗酶液、0.1 mol/l pH值8.0磷酸緩沖溶液和蒸餾水按3：2：5比例混合組成的酶混合液與1 ml含有5 mmol/l氧化型谷胱甘肽（GSSG）、5 mmol/l苯甲基磺酰氟(PMSF)的磷酸鹽緩沖溶液（pH值7.0）混合，在40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h。2 000×g離心10 min，取1.5 ml上清液與2.5 ml含有1 mM EDTA的pH值8.0磷酸緩沖液混合，加入100 μl Ellman試劑，靜置5 min待顏色穩(wěn)定時(shí)于412 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算巰基含量。酶對(duì)照組為加入1 ml pH值7.0的磷酸緩沖溶液取代氧化型谷胱甘肽的處理組。酶活定義：1 kU二硫鍵還原酶活性相當(dāng)于每毫升酶在40℃下每分鐘釋放出1 μmol巰基。

圖1 菌株CP-7完整羽毛降解

1.4.5 巰基與可溶性蛋白含量測(cè)定

巰基測(cè)定參考Ellman的方法并適當(dāng)修改，可溶性蛋白含量運(yùn)用Bradford法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、鑒定

2.1.1 菌株的分離篩選

對(duì)采集的樣品富集稀釋并涂布羽毛選擇平板培養(yǎng)，共挑取27株平板產(chǎn)水解圈能力較強(qiáng)的菌株。將其于羽毛選擇平板上傳代馴化，并進(jìn)行完整羽毛降解實(shí)驗(yàn)。最終得到1株能夠完全降解羽毛的菌株CP-7，其在5 d內(nèi)徹底降解完整羽毛(見(jiàn)圖1),故對(duì)其深入研究。

2.1.2 菌株鑒定

菌株CP-7生長(zhǎng)于營(yíng)養(yǎng)平板培養(yǎng)基，24 h后菌落直徑可達(dá)4 mm，菌落呈白色扁平狀，表面褶皺且多顆粒，粘稠，邊緣不整齊并伴有絲狀外延（見(jiàn)圖2）。

圖2 菌株CP-7菌群形態(tài)

經(jīng)PCR手段擴(kuò)增得到菌株CP-7的部分16S rDNA序列(見(jiàn)圖3),測(cè)序發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度為1 422 bp,序列提交至Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，接收號(hào)JN628975。將序列進(jìn)行Blast比對(duì)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得相關(guān)菌株16S rDNA序列，應(yīng)用Clustal X1.83進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MEGA4中Neighbor-joining方法建樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖4所示，CP-7與地衣芽孢桿菌位于同一分支，同源性可達(dá)99%，初步判定該菌株為地衣芽孢桿菌，命名為Bacillus licheniformis CP-7。

圖3 菌株16S rDNA電泳圖譜

圖4 菌株CP-7系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 篩選菌對(duì)羽毛角蛋白的降解與機(jī)制分析

2.2.1 發(fā)酵液中可溶性蛋白含量與角蛋白酶活性

發(fā)酵液中可溶性蛋白含量和角蛋白酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（見(jiàn)圖5、圖6），空白對(duì)照發(fā)酵液中可溶性蛋白產(chǎn)量低、變化小，而CP-7發(fā)酵液中可溶性蛋白含量在48 h最高，可達(dá)0.26mg/ml，之后隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。角蛋白酶活性隨發(fā)酵時(shí)間而逐漸增加，96 h酶活達(dá)到最高（8.43 U/ml），但72 h酶活性明顯近于穩(wěn)定，可見(jiàn)角蛋白酶是該菌降解羽毛的基礎(chǔ)。

圖5 發(fā)酵液中可溶性蛋白變化

2.2.2 發(fā)酵液中巰基和含硫離子

CP-7發(fā)酵液中巰基濃度隨發(fā)酵時(shí)間逐漸升高（見(jiàn)圖7），96 h達(dá)到119 μM，這與角蛋白酶活力的變化趨勢(shì)一致，而空白對(duì)照發(fā)酵液中的巰基濃度幾乎無(wú)變化，這說(shuō)明該菌株在降解羽毛角蛋白過(guò)程中有大量二硫鍵被還原。

圖6 發(fā)酵產(chǎn)酶情況

圖7 發(fā)酵液中巰基濃度變化

對(duì)菌株CP-7發(fā)酵液中亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽等含硫離子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上清液添加氯化鐵后并不顯紫色，酸化至pH值3.0后未出現(xiàn)渾濁，表明硫代硫酸鹽檢測(cè)呈陰性。當(dāng)加入BaCl2溶液后，上清液出現(xiàn)白色沉淀，并且沉淀可以使KMnO4脫色，表明菌體在代謝過(guò)程中有亞硫酸鹽產(chǎn)生。這說(shuō)明發(fā)酵液中的巰基可能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為了亞硫酸鹽。

2.2.3 胞內(nèi)、胞外液中酶活組成

分別以羽毛、羊毛和酪蛋白為底物檢測(cè)胞內(nèi)酶液、胞外酶液和胞內(nèi)胞外混合酶液中蛋白酶活性。結(jié)果表明，以羽毛粉為底物時(shí)混合酶液角蛋白酶活性（7.13 U/ml）約為胞外酶液角蛋白酶活性（2.9 U/ml）2.5倍（P＜0.01），以羊毛為底物時(shí)兩者差異亦極顯著（P＜0.01），但酪蛋白水解活性差異不顯著（P＞0.05）（見(jiàn)圖8、圖9）。胞內(nèi)酶液僅在以羊毛為底物時(shí)檢測(cè)到微弱角蛋白酶活性（0.25 U/ml），以羽毛和酪蛋白為底物時(shí)均未檢測(cè)到蛋白酶活性。

圖8 胞內(nèi)、胞外、混合酶液角蛋白水解活性

圖9 胞內(nèi)、胞外、混合酶液酪蛋白水解酶活性

該菌胞內(nèi)、胞外酶液二硫鍵還原酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況見(jiàn)圖10。胞外酶液各時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到二硫鍵還原酶活性，而胞內(nèi)酶液均檢測(cè)到二硫鍵還原酶活性，表明胞內(nèi)二硫鍵還原酶可能是胞外角蛋白酶活性提高的主要原因。其在發(fā)酵初始就達(dá)到較高水平，并在36 h達(dá)到最大，隨后迅速降低，這與胞外角蛋白酶產(chǎn)生規(guī)律不同。

圖10 胞內(nèi)、胞外液二硫鍵還原酶活性

3 討論

角蛋白降解菌的篩選通常以產(chǎn)透明圈大小和酶活性高低為篩選標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)則以透明圈和完整羽毛降解法，獲得了1株可高效降解角蛋白菌株，經(jīng)鑒定命名為Bacillus licheniformis CP-7。該菌可在5 d內(nèi)將完整羽毛徹底降解，較之多數(shù)已知菌株降解角蛋白的能力強(qiáng)。地衣芽孢桿菌PWD-1為研究最為深入的降解菌，但其徹底降解羽毛需6 d[11]。吳小倫[12]和Suntornsuk[13]用透明圈法分別分離到短黃桿菌ZDM(Flavobacterium breve ZDM)和Bacillus sp.FK46，兩者搖瓶發(fā)酵5 d后羽毛被強(qiáng)烈降解，但均無(wú)法完全利用羽軸。由此可見(jiàn)，利用透明圈和完整羽毛降解相結(jié)合的方法篩選角蛋白降解菌更為有效。

當(dāng)前關(guān)于角蛋白降解假說(shuō)較多，但其核心均為二硫鍵的裂解。菌株CP-7發(fā)酵過(guò)程中還原得到大量巰基，同時(shí)伴有可溶性蛋白、角蛋白酶的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CP-7胞內(nèi)液具有二硫鍵還原酶活性，并對(duì)胞外角蛋白酶活性具有顯著地促進(jìn)作用，這表明其胞內(nèi)的二硫鍵還原酶參與了角蛋白降解過(guò)程。Yamamura等[4]在嗜麥芽窄食單胞菌D-1中分離到了蛋白水解酶和二硫鍵還原酶。研究表明，兩種酶并不獨(dú)立起作用，而同時(shí)用于羽毛降解時(shí)，其蛋白酶水解活性比單獨(dú)使用提高約50多倍。另外，在蠟樣芽孢桿菌[5]、B.licheniformis RG1[6]和Bacillus halodurans PPKS-2[7]發(fā)酵液中也檢測(cè)到了二硫鍵還原酶活性，且對(duì)角蛋白酶具有激活作用。此外，二硫鍵還原酶可明顯提高枯草芽孢桿菌蛋白酶、胰蛋白酶以及蛋白酶K水解角蛋白的活性[4]。本研究還發(fā)現(xiàn)，二硫鍵還原酶活性在角蛋白降解初期較高，這或許與二硫鍵的早期斷裂相關(guān)。因此，二硫鍵還原酶在CP-7羽毛角蛋白降解中具有重要作用，促進(jìn)了二硫鍵的裂解。

角蛋白二硫鍵的還原不僅與二硫鍵還原酶有關(guān)，其它化學(xué)因素也可能是破壞二硫鍵的重要原因。Onifade[14]發(fā)現(xiàn)幾種角蛋白降解真菌產(chǎn)生的亞硫酸鹽可以對(duì)角蛋白進(jìn)行硫解。Kunert[1]也認(rèn)為代謝產(chǎn)生的亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽可能加速了二硫鍵裂解。王玲[15]發(fā)現(xiàn)在羽毛發(fā)酵過(guò)程中加入適當(dāng)濃度的亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽可以促進(jìn)角蛋白降解。本研究在CP-7發(fā)酵液中也檢測(cè)到了亞硫酸鹽，但未檢測(cè)到硫代硫酸鹽。因此，CP-7裂解角蛋白二硫鍵與硫解作用可能具有密切關(guān)系。

4 結(jié)語(yǔ)

基于上述研究可知，運(yùn)用透明圈和完整羽毛降解相結(jié)合的方法篩選角蛋白降解菌更為有效。篩選菌CP-7胞內(nèi)二硫鍵還原酶顯著促進(jìn)胞外角蛋白水解活性，這可能與二硫鍵還原酶裂解二硫鍵有關(guān)。此外，代謝產(chǎn)生的亞硫酸鹽與角蛋白降解亦可能密切相關(guān)。

[1]Kunert J,Stransky Z.Thiosulfate production from cysteine by the keratinolytic prokaryote Streptomyces fradiae[J].Arch Microbiol,1988,82:600-601.

[2]Figueras M J,Guarro J.X-ray microanalysis of black piedra[J].Antonie van Leeuwenhoek.1997(4).

[3]Nickerson W J,Noval J J,Robison R S.Keratinase:I.Properties of the enzyme conjugateelaborated by Streptomycesfradiae.Biochimica et Biophysica Acta,1963,77:73-86.

[4]Yamamura S,Morita Y,Hasan Q,et al.Keratin degradation:a cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp.[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,294：1138-1143.

[5]Prakash P,Senigala K,Jayalakshmi,et al.Purification and characterization of extreme alkaline,thermostable keratinase,and keratin disulfide reductase produced by Bacillus halodurans PPKS-2[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87:625-633.

[6]Ramnani P,Singh R,Gupta R.Keratinolytic potential of Bacillus licheniformis RG1:structural and biochemical mechanism of feather degradation[J].Canadian Journal of Microbiology,2005,51(3):191-196.

[7]Ghosh A,Chakrabarti K,Chattopadhyay D.Degradation of raw feather by a novel high molecular weight extracellular protease from newly isolated Bacillus cereus DCUW[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2008,35:825-834.

[8]Gradis?ar H,Kern S,Friedrich J.Keratinase of Doratomyces microspores.Appl Microbiol Biotechnol,2000,53:196-200.

[9]Ellman G L.Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys,1959,82:70-77.

[10]Brown D M,Upcroft J A,Upcroft P.A thioredoxin reductaseclass of disulphide reductase in the protozoan parasite Giardia duodenalis.Mol Biochem Parasitol,1996,83:211-220.

[11]Williams C M,Richter C S,Mackenzie J M,et al.Isolation,I-dentification,and Characterization of a Feather-Degrading Bacteriumt.Applied and environmental microbiology,1990,7:1509-1515.

[12]吳小倫.羽毛角蛋白降解菌(Flavobacterium breve ZDM)的分離、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2001.

[13]Suntornsuk W,Suntornsuk L.Feather degradation by Bacillus sp.FK46 in submerged cultivation[J].Bioresource Technology,2003,86：239-243.

[14]Onifade A A,Al-Sane N A,Al-Musallam A A,et al.A Review:Potentials for biotechnological applications of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resources[J].Bioresour Technol,1998,66:1-11.

[15]王玲.Bacillus Licheniformis NJU-1411-1固體發(fā)酵羽毛角蛋白生化機(jī)制研究——含硫化合物的轉(zhuǎn)化及作用[D].南京:南京大學(xué),2011.