龍 文，邱李恒，孟 超，林巖松

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100730

2北京大學(xué)人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100044

Graves病是一種主要累及甲狀腺的自身免疫性疾病，目前在動(dòng)物身上尚無(wú)自發(fā)發(fā)生的報(bào)道。自上世紀(jì)90年代中期起，研究者們便開始給動(dòng)物注射促甲狀腺激素受體 (thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)蛋白誘導(dǎo)Graves病，但均未取得滿意結(jié)果。20世紀(jì)末，有研究者通過注射具有免疫活性的細(xì)胞制備小鼠模型，并成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了TSHR抗體(thyroid stimulating antibody，TSAb)［1-2］。得益于基因工程的發(fā)展，研究人員通過注射含TSHR基因或其片段的裸質(zhì)?；蛳俨《局苽銰raves病模型，取得了較好的效果［3-5］。Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TSHR 蛋白的A亞基 (A subunit of thyroid-stimulating hormone receptor，TSHRA)基因可能較TSHR全長(zhǎng)基因能夠產(chǎn)生更高水平的TSAb。此后，Kaneda等［7］通過電穿孔直接把TSHRA基因轉(zhuǎn)染入小鼠肌肉細(xì)胞，不僅取得了較高的表達(dá)率，而且得到了持久的TSAb表達(dá)，進(jìn)而距離成功的Graves病動(dòng)物模型又近了一步。近年來(lái)，又出現(xiàn)了注射牛甲狀腺球蛋白誘導(dǎo)Graves病的嘗試［8］，但需要很漫長(zhǎng)的探索過程。由于用腺病毒或電穿孔方法對(duì)技術(shù)要求較高，耗資較大，而脂質(zhì)體注射是目前常用的一種簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)基因手段，尚未用于Graves病動(dòng)物模型研究，本研究擬以脂質(zhì)體注射的形式免疫雌性Balb/c小鼠誘導(dǎo)Graves病，并比較了不同質(zhì)粒載體、目標(biāo)基因和免疫程序?qū)φT導(dǎo)率的影響。

材料和方法

材料 TSHR cDNA、Lipofectine TM2000(美國(guó)Invitrogen公司)，EcoRⅠ 和NotⅠ限制性內(nèi)切酶 (日本 TaKaRa公司)，Escherichia coli DH5α、Escherichia coli BL21(DE3)、pUBC質(zhì)粒、pCDNA3.1(+)，pETis質(zhì)粒［中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，由pET28a(+)質(zhì)粒改造而來(lái)］，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、T4 DNA連接試劑盒、PCR用 Taq酶等材料 (美國(guó) Axygen公司)，游離三碘甲狀腺原氨酸 (FT3)及游離甲狀腺素(FT4)放射性免疫分析藥盒 (北方生物所)。

質(zhì)粒構(gòu)建 以EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切載有TSHR基因的質(zhì)粒和pUBC/pCDNA3.1(+)質(zhì)粒，連接構(gòu)建pUBC-TSHR/pCDNA3.1(+)-TSHR載體。分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增TSHR和TSHRA編碼區(qū)的引物序列。TSHR-wF:5'-GAATTCATGAGGCCGGGGGACTTGCT-3'(EcoRⅠ);TSHT-wR:5'-GCGGCCGCACTTTGGGGTTAGATGGGAGT-3'(NotⅠ);TSHRAR:5'-GCGGCCGCAAGCACAGCACAGCAGTGGCTTGGG-3'(NotⅠ)。PCR產(chǎn)物酶切后與載體連接，得到真核表達(dá)載體pUBC-TSHR/pCDNA3.1(+)-TSHR和pUBC-TSHRA/pCDNA3.1(+)-TSHRA，構(gòu)建成功的載體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)Balb/c雌性小鼠66只(6周齡)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，隨機(jī)分入以下5組:(1)pUBC-TSHR組(n=10);(2)pUBC-TSHRA組(n=10);(3)pCDNA3.1(+)-TSHR組(n=15);(4)pCDNA3.1(+)-TSHRA組(n=15);(5)對(duì)照組 (n=16)，其中pUBC組同期6只，pCDNA組同期10只。

動(dòng)物免疫 取已構(gòu)建好的pUBC-TSHR、pUBCTSHRA(pUBC組)分別用磷酸鹽緩沖液 (PBS)稀釋至1 mg/ml后用脂質(zhì)體包封。在小鼠四肢肌肉或皮下進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫，劑量為50μg/只，分別在初次免疫后第3周、第5周用相同劑量的DNA加強(qiáng)免疫。pCDNA3.1(+)-TSHR、pCDNA3.1(+)-TSHRA處理組 (pCDNA組)與pUBC組類似，但采用不同的免疫程序，分別在初次免疫后1周、2.5周、5周加強(qiáng)免疫。每1～2周記錄小鼠體重并經(jīng)尾靜脈采血。pCDNA組中兩實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各挑選8只動(dòng)物在初次免疫后10、14周再次加強(qiáng)免疫，并在末次免疫13 d后處死取血。上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

血清TRAb、FT3及FT4測(cè)定 建立TSHR的原核表達(dá)載體 pETis-TSHR，用 Escherichia coli BL21(DE3)表達(dá)TSHR抗原，用鎳柱親和層析方法純化TSHR抗原。間接ELISA法檢測(cè)每次免疫后小鼠血清TRAb濃度，血樣均從1∶20開始等比稀釋。放射免疫法測(cè)定小鼠血清FT3、FT4。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R統(tǒng)計(jì)軟件 (版本:2.10.1)，動(dòng)物體重及 FT3、FT4以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示;在TSHR組、TSHRA組及對(duì)照組間進(jìn)行比較時(shí)，先用Shapiro法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，Bartlett法檢驗(yàn)方差齊性，符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)，用ANOVA方差分析法檢驗(yàn)3組間的均值差異;不符合者使用Kruskal-Willis法;3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再用t檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。處理間接ELISA所得數(shù)據(jù)時(shí)，用四參數(shù)Logistic回歸法擬合對(duì)照組OD值得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的TRAb相對(duì)濃度，該處理過程使用ELISA軟件進(jìn)行［9］。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

體重變化 pUBC組經(jīng)過4次免疫，觀察期為42 d;pCDNA組經(jīng)過6次免疫，觀察期為109 d。pUBC組及pCDNA組均在第40～42天內(nèi)完成前4次免疫的觀察，其體重總體呈上升趨勢(shì)，但后者的體重曲線出現(xiàn)了分離，尤其是在初次免疫2.5周后 (第3次免疫后)，TSHRA亞組體重增長(zhǎng)明顯變緩，曲線呈平臺(tái)趨勢(shì) (圖1)。pUBC兩亞組與對(duì)照組的體重變化只在初次免疫后3周內(nèi) (前2次免疫期間)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.013)，TSHRA亞組的體重增長(zhǎng)明顯快于TSHR組和對(duì)照組 (P=0.008)，pCDNA兩亞組與對(duì)照組的體重變化則在初次免疫后的第1周內(nèi)及2.5周后 (第1、3、4次免疫后)均有顯著性差異 (P=0.015，P=0.001，P=0.005)(表1)。pCDNA組6次免疫后TSHRA、TSHR亞組體重增長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組 (P=0.005)(圖3)。

圖1 pUBC組與pCDNA組在免疫過程中的體重變化Fig 1 Weight changes in pUBC and pCDNA groups during the immunization

表1 pCDNA組兩亞組及對(duì)照組體重變化兩兩比較P值Table 1 P-value of weight change between two subgroups of pCDNA group and control group

血清TRAb相對(duì)濃度 pUBC和pCDNA組OD值標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸系數(shù)r2均大于0.99。pUBC組在免疫過程中血TRAb相對(duì)濃度在初期 (前35 d)升高不明顯，觀察結(jié)束后 (初次免疫后42 d)也僅升高到初始值的3～4倍，且TSHR和TSHRA亞組的血清TRAb相對(duì)濃度沒有明顯差異。pCDNA組血TRAb相對(duì)濃度則呈明顯的上升趨勢(shì)，在初次免疫后20 d內(nèi)即已升高到初始值的2倍左右，而初次免疫后40 d則升高到了5～7倍。其中，兩亞組血TRAb相對(duì)濃度則表現(xiàn)出明顯的差異，在初次免疫26 d后 (第3次免疫后9 d)，TSHRA亞組的TRAb水平增長(zhǎng)幅度明顯高于TSHR組 (圖2)。pCDNA組在6次免疫后只有TSHRA亞組中的2例 (2/7)仍表現(xiàn)出明顯的TRAb升高 (圖3)。

圖2 pUBC和pCDNA組在免疫過程中血清TRAb相對(duì)濃度的變化Fig 2 Relative concentration of serum TRAb in pUBC and pCDNA groups

圖3 pCDNA組6次免疫后FT3、FT4、體重增長(zhǎng)和TRAb相對(duì)濃度Fig 3 FT3，F(xiàn)T4，weight gain，and relative TRAb concentration in pCDNA group after 6 immunization procedures，A，F(xiàn)，and WT in the x-axis represents TSHRA，TSHR，and control groups respectively

血清FT3、FT4 pCDNA組在6次免疫結(jié)束后，TSHRA及TSHR亞組的FT3水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.276)，但FT4明顯高于對(duì)照組 (P=0.023)(圖3)。在分析FT3與體重增長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)時(shí)，兩者的關(guān)聯(lián)圖在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間沒有區(qū)域性分布的趨勢(shì)。FT4與體重增長(zhǎng)的關(guān)聯(lián)圖則在組間表現(xiàn)出了較明顯的區(qū)域性分布，F(xiàn)T4與體重增長(zhǎng)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與TRAb間沒有表現(xiàn)出明顯的關(guān)聯(lián) (圖4)。

討 論

pUBC和pCDNA3.1(+)都是常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，但二者啟動(dòng)子不同，前者為hUbC啟動(dòng)子，后者為CMV啟動(dòng)子，本研究中分別采用這兩種載體進(jìn)行了構(gòu)建Graves病模型的嘗試。模型如果構(gòu)建成功，動(dòng)物應(yīng)該具有較高的血清TRAb相對(duì)濃度，或者TRAb濃度呈持續(xù)升高趨勢(shì)。血清甲狀腺激素水平應(yīng)該升高或呈升高趨勢(shì)［3，10-11］。而作為甲狀腺毒癥的經(jīng)典表現(xiàn)之一，在同樣飼養(yǎng)環(huán)境下，動(dòng)物的體重增長(zhǎng)應(yīng)比較緩慢或呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，pUBC組兩亞組體重變化趨勢(shì)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而pCDNA組兩亞組體重增長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組，尤其是在3次免疫后 (2.5周后)，甚至出現(xiàn)體重平臺(tái)或下降。通過觀察兩組血TRAb變化規(guī)律，pUBC組升高程度有限，42 d后僅為初始值的4～5倍，而pCDNA組在初次免疫后20 d內(nèi)即觀察到血TRAb明顯升高，40 d時(shí)達(dá)初始值的5～7倍，提示就體重和TRAb而言，pCDNA組具有更高的模型誘導(dǎo)率。

Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TSHRA基因具有更高的TSAb誘導(dǎo)率，本研究亦對(duì)TSHR全長(zhǎng)和TSHRA基因的誘導(dǎo)效率進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCDNA的TSHRA亞組體重增長(zhǎng)在第3、4次免疫期間明顯慢于TSHR亞組，此后的體重變化曲線出現(xiàn)了分離;TRAb的變化亦呈同樣趨勢(shì)。pCDNA組6次免疫后，雖然TSHRA及TSHR亞組的FT4水平均明顯高于對(duì)照組，但只有TSHRA亞組呈現(xiàn)高水平的TRAb;提示與TSHR全長(zhǎng)基因相比，TSHRA基因能夠更有效的誘導(dǎo)TRAb及甲狀腺毒癥的產(chǎn)生。

本研究通過首次免疫和3周后的2次加強(qiáng)免疫來(lái)實(shí)現(xiàn)pUBC組TRAb的高水平表達(dá)，但并沒有得到預(yù)期結(jié)果，推測(cè)其原因可能是首次免疫和加強(qiáng)免疫的間隔過長(zhǎng)。在pCDNA組采用不同的免疫程序，縮短免疫間隔，得到了預(yù)期的結(jié)果，提示縮短免疫間隔有助于提高模型誘導(dǎo)率。pCDNA3.1(+)本身的高效也可能是造成這種差別的原因之一。

TSH是反映甲狀腺功能最靈敏的指標(biāo)，但由于小鼠TSH試劑盒難以獲得，本研究測(cè)定了小鼠的FT3和FT4，結(jié)果提示FT4與體重變化具有較明顯的關(guān)聯(lián)，而FT3的關(guān)聯(lián)性較差。這一結(jié)果與Rao等［5］的研究結(jié)果相符。美國(guó)甲狀腺學(xué)會(huì)有關(guān)甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的指南也指出FT4與TSH存在負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，可通過聯(lián)合檢測(cè)提高甲亢診斷的準(zhǔn)確性，而FT3的檢測(cè)方法尚存在缺陷，難以作為一個(gè)靈敏的甲亢監(jiān)測(cè)指標(biāo)［12］。因此，筆者認(rèn)為在Graves病動(dòng)物模型建立及研究中，采用FT4來(lái)監(jiān)測(cè)模型的甲狀腺功能更為合適。

綜上，本研究結(jié)果顯示，pCDNA3.1(+)載體、TSHRA基因、縮短免疫間隔有助于提高模型誘導(dǎo)效率，F(xiàn)T4是監(jiān)測(cè)模型甲狀腺功能的合適指標(biāo)。

圖4 FT3、FT4與體重增長(zhǎng)及FT4與TRAb水平的關(guān)聯(lián)Fig 4 Correlation among FT3，F(xiàn)T4 and weight gain，together with that between FT4 and TRAb

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