田 昕，羅 穎，閆永波，隋承光，孟凡東，劉云鵬

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤實驗室，沈陽 110001

2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽 110001

3沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，沈陽 110016

4本溪市中心醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 本溪 117000

食管癌是侵襲能力最強的惡性腫瘤之一，居全世界最常見消化道腫瘤的第3位。食管癌通過手術(shù)及現(xiàn)行的放化療很難達到根治，因此必須尋找包括新型抗癌藥物在內(nèi)的其他治療手段［1－2］。蟾蜍靈又稱蟾毒靈，是中藥蟾酥的主要配基之一，為多羥基甾體類化合物，具有抗炎、止痛及強心等多種藥理作用。研究表明，蟾蜍靈還可抑制白血病、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌及肺癌等多種腫瘤細胞凋亡［3－8］，但目前尚無有關(guān)食管癌方面的報導(dǎo)。線粒體不僅能誘導(dǎo)細胞凋亡，還是細胞凋亡的執(zhí)行者，很多核編碼蛋白是通過線粒體轉(zhuǎn)位發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用的。端粒酶是一種核糖核蛋白復(fù)合物，在90%以上的腫瘤細胞中高表達，主要存在于細胞核，其主要功能是延長端粒保護染色體穩(wěn)定。越來越多的研究顯示，人端粒酶的主要催化亞基—人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (human telomerase reverse transcriptase，hTERT)還具有核外定位 (主要是線粒體定位)等非端粒依賴的功能，但目前對hTERT核－線粒體轉(zhuǎn)位在腫瘤細胞凋亡中的作用與機制尚不清楚。本研究通過觀察蟾蜍靈對人食管鱗癌EC9706細胞增殖和凋亡的影響，探討其對hTERT核－線粒體定位的影響。

材料和方法

主要試劑和儀器 蟾蜍靈、碘化丙啶 (propidium Iodide，PI)、RNase A及 Hoechst 33342購自美國Sigma公司，Cell Counting Kit(CCK－8)、Annexin VFITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體/細胞核提取試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，hTERT兔抗人抗體購自美國Rockland公司，增殖細胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ (cytochrome c oxidase subunitⅣ，COXⅣ)、兔抗人抗體及山羊抗兔二抗購自美國Santa cruz公司，ECL底物發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，Mitotracker Red、Alexa Fluro 488熒光標(biāo)記二抗購自美國Invitrogen公司。SUNRISE RC酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio－Rad公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自以色列DNR公司，F(xiàn)V1000S激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

細胞培養(yǎng) 人食管鱗癌EC9706細胞系購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。細胞單層接種于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI－1640(Gibco，USA)中，培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

CCK-8法測定細胞增殖率 取對數(shù)生長期的EC9706細胞用胰酶消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×104/ml接種于96孔板中，細胞培養(yǎng)24 h貼壁后加入不同濃度蟾蜍靈 (1、10、20、50、100 nmol/L)，設(shè)空白對照，每組6個復(fù)孔。分別孵育24、48、72 h后在各孔中加入10 μl CCK－8溶液，37℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度 (OD值)，計算細胞生長的抑制率。細胞生長抑制率=(對照組OD均值－給藥組OD均值)/對照組OD均值×100%，實驗重復(fù)3次取其均值，計算半數(shù)抑制濃度 (IC50)。

細胞周期檢測 收集并調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，用體積分數(shù)為70%乙醇固定 (4℃過夜)，染色前加RNase A(10 mg/ml)37℃ 放置 30 min，加入 PI(100μg/ml)避光染色15 min，流式細胞儀測定DNA含量，cell quest軟件分析細胞周期。

Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)

以每孔5×105/ml細胞密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后加藥干預(yù)，藥物處理后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗兩遍，加入Hoechst 33342染色液避光反應(yīng)5 min，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。

AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 消化細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至1×106/ml，300 g 4℃離心10 min，棄上清液。將細胞重懸浮于500 μl結(jié)合緩沖液中，加入 5 μl AnnexinV－FITC 和5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min流式細胞儀檢測凋亡。

Western blot法檢測hTERT蛋白的表達 將細胞刮下，PBS洗滌，800 g 5 min離心收集，每次需要約5×108細胞以上。加入1.5 ml預(yù)冷裂解液重懸，轉(zhuǎn)至玻璃勻漿器內(nèi)冰浴研磨30次。將細胞勻漿移至離心管，4℃ 800 g離心5 min。取沉淀加入0.5 ml Medium Buffer A重懸，將另一預(yù)冷離心管中加入1 ml Medium Buffer B，將懸液置于Medium Buffer B之上，4℃ 1000 g離心10min，用100 μl Nuclear Store Buffer重懸細胞核沉淀;在另一個預(yù)冷離心管中預(yù)先加入0.5 ml Medium Buffer C，取上清沿管壁緩慢覆蓋于Medium Buffer C上層，4℃ 15000 g離心10 min。加0.2 ml Wash Buffer重懸沉淀，4℃ 15000 g離心10 min，用 100 μl Mitochondria Store Buffer重懸線粒體沉淀。分別測定細胞核/線粒體蛋白濃度，逐步進行上樣、10%SDS－PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)印、封閉、抗體孵育、底物發(fā)光等步驟顯示特異蛋白條帶，分別以PCNA及COXⅣ作為細胞核與線粒體蛋白內(nèi)參。

多重免疫熒光標(biāo)記激光共聚焦顯微鏡觀察hTERT亞細胞定位 將載玻片過酸高壓滅菌后置于6孔板中，1×104/ml密度接種細胞孵育24 h后加入蟾毒靈，處理結(jié)束后PBS清洗3次，用40 g/L多聚甲醛－20℃固定15 min，1%BSA封閉30 min，PBS清洗3次后加入hTERT一抗過夜，先后加入Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記二抗 1 h、Mitotracker Red 30 min及 Hoechst 3334215 min，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下分別在發(fā)射波長487、599和520 nm觀察藍色、紅色及綠色熒光并合成圖像。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，P﹤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

蟾蜍靈對人食管鱗癌EC9706細胞增殖的影響CCK－8檢測結(jié)果顯示，以1、10、20、50、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用人食管鱗癌EC9706細胞24、48、72 h，蟾蜍靈以時間及劑量依賴方式抑制EC9706細胞增殖(P＜0.01)，24、48、72 h的 IC50分別為(98.26±6.38)、(40.32±3.62)、(19.45.45±1.41)nmol/L(圖 1)。

圖1 蟾蜍靈以時間及濃度依賴方式抑制人食管鱗癌EC9706細胞增殖Fig 1 Bufalin suppressed the proliferation of human esophageal squamous carcinoma EC9706 cells in a time－and dose－dependent manner

蟾蜍靈抑制人食管鱗癌EC9706細胞增殖過程中對細胞周期的影響 以100 nmol/L蟾蜍靈作用于EC9706細胞6、12、24、48 h，與對照組相比，G1期細胞由 (66.91±5.26)%逐漸降至 (50.54±4.22)%、(30.51±2.86)%、(9.38±1.25)%、(0.03±0.01)%，而S期細胞由 (21.64±2.04)%分別增至(30.62±2.85)%、(45.21±3.82)%、(60.67±5.23)%、(67.05±5.86)%(P均＜0.05);G2/M期細胞則由(11.45±1.20)%分別增至(18.84±1.63)%、(24.28±2.52)%、(29.05±3.02)%、(32.92±3.83)%(P均＜0.05);亞二倍體期 (sub G1)細胞由0(0 h)增至 (9.23±1.51)%(24 h)及 (25.56±2.86)%(48 h)(圖2)。

蟾蜍靈誘導(dǎo)人食管鱗癌EC9706細胞凋亡 Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，100 nmol/L蟾蜍靈處理人食管鱗癌EC9706細胞6、12、24、48 h，細胞出現(xiàn)典型凋亡的三期形態(tài)學(xué)改變:Ⅰ期細胞核皺縮呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài);Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體;對照組細胞核呈藍色，邊緣光滑完整，均勻淡染 (圖3)。Annexin V－FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，凋亡率分別由對照組的 (1.21±0.58)% 增加至(6.21±1.36)%、 (11.64±2.15)%、 (20.78±3.22)%、(33.92±3.84)%(P＜0.01)(圖4)。

蟾蜍靈在誘導(dǎo)人食管鱗癌EC9706細胞凋亡過程中對 hTERT的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，hTERT蛋白不僅在EC9706細胞核內(nèi)表達，還表達于線粒體中。100 nmol/L蟾蜍靈作用12、24、48 h，細胞核內(nèi)hTERT蛋白表達逐漸下調(diào)，分別減少至對照組的 (70.55±6.26)%、(53.78±4.85)%、(42.66±4.03)%(P均＜0.05)，而線粒體hTERT蛋白的表達逐漸上調(diào)，與對照組相比分別增加 (8.03±0.52)%、(15.52±1.27)%、(27.16±2.01)%(P均＜0.05)(圖5)。多重免疫熒光標(biāo)記結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，除細胞核外，hTERT還定位于線粒體中，100 nmol/L蟾毒靈作用12、24、48 h，部分hTERT由細胞核轉(zhuǎn)位至線粒體 (圖6)。

圖2 蟾蜍靈處理誘導(dǎo)EC9706細胞周期阻滯及凋亡Fig 2 Treatment with bufalin induced cell cycle arrest and apoptosis in EC9706 cells

圖3 蟾蜍靈誘導(dǎo)EC9706細胞凋亡的胞核形態(tài)改變 (Hoechst，×400)Fig 3 Morphological changes of nucleus in apoptotic EC9706 cells induced by bufalin(Hoechst， ×400)

圖4 蟾蜍靈誘導(dǎo)EC9706細胞凋亡Fig 4 Bufalin induced apoptosis in EC9706 cells

圖5 Western blot檢測EC9706細胞hTERT胞核及線粒體蛋白表達Fig 5 Protein expression of hTERT in the nucleus and mitochondria of EC9706 cells(Western blot analysis)

圖6 蟾蜍靈誘導(dǎo)EC9706細胞hTERT核－線粒體轉(zhuǎn)位 (×600)Fig 6 Bufalin induced hTERT nuclear－mitochondrial translocation in EC9706 cells(× 600)

討 論

食管癌在我國主要以鱗狀細胞癌 (esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為主，進展快、死亡率高，為第4大腫瘤相關(guān)死亡原因。ESCC根治切除不僅創(chuàng)傷大易復(fù)發(fā)，常用的化療藥物對ESCC術(shù)后復(fù)發(fā)的治療效果并不理想。因此，尋找新型敏感藥物對于ESCC的治療來說勢在必行。本研究結(jié)果證實，蟾蜍靈可在體外以時間和劑量依賴方式抑制人食管鱗癌細胞EC9706增殖，隨作用時間的延長，蟾蜍靈顯著阻礙細胞周期進程，逐漸將細胞阻滯于S及G2/M期而不能順利通過檢查點進入下一細胞周期，從而誘導(dǎo)凋亡。筆者以往研究顯示，蟾蜍靈在誘導(dǎo)白血病HL－60細胞凋亡過程中，可降低Bcl/Bax比值，下調(diào)Survivin蛋白表達，促進線粒體促凋亡因子Smac/DIIABLO的釋放，與其他學(xué)者報道的線粒體凋亡途徑可能參與蟾蜍靈誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡的結(jié)論一致［4－5，8］，但目前對蟾蜍靈誘導(dǎo)的線粒體凋亡通路的調(diào)控機制仍需進一步研究。

線粒體不僅是維持細胞能量代謝和生命活動的控制中心，還是細胞凋亡的調(diào)控中心。多種抗癌藥物通過線粒體內(nèi)在途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，線粒體已成為篩選新型抗腫瘤藥物的重要靶標(biāo)［9］。線粒體還是除細胞核外唯一具有基因組DNA的細胞器，共編碼37個基因，但是在線粒體中發(fā)現(xiàn)的基因編碼產(chǎn)物卻超過1000個，其中98%以上的線粒體蛋白是由細胞核基因組編碼并轉(zhuǎn)運至線粒體中的［10］。hTERT是人端粒酶的主要調(diào)控亞單位，是決定端粒酶活性的關(guān)鍵因素。hTERT表達水平的高低與端粒酶的活性密切相關(guān)，并在正常和癌組織中存在差異性表達。hTERT是一種RNA依賴的DNA聚合酶，可以端粒酶自身的RNA組分 (hTR)為模板逆轉(zhuǎn)錄合成染色體末端結(jié)構(gòu)—端粒DNA，穩(wěn)定端粒長度以維持染色體的完整性。近年研究發(fā)現(xiàn)，hTERT蛋白分別具有核定位、核輸出及線粒體定位序列，可在細胞核與線粒體之間動態(tài)穿梭。由于端粒結(jié)構(gòu)只存在于細胞核染色體末端，端粒酶只有在細胞核中才能發(fā)揮其保護端粒的功能，因此，hTERT的線粒體定位提示端粒酶還具有其他非端粒依賴的功能［11－16］。目前，對hTERT線粒體定位的功能及核－線粒體轉(zhuǎn)位的機制還存在爭議，有研究認為，線粒體hTERT在細胞中行使與核hTERT不同的功能，是hTR非依賴的逆轉(zhuǎn)錄酶;hTERT線粒體轉(zhuǎn)位對線粒體具有不利影響，使細胞更易受到氧化應(yīng)激的損傷，為線粒體受損及凋亡的決定因素［12－14］。另一些研究卻認為，氧化應(yīng)激和藥物可導(dǎo)致hTERT從細胞核轉(zhuǎn)位到線粒體，降低細胞活性氧水平、改善線粒體功能，并降低應(yīng)激條件下線粒體 DNA(mtDNA)的損傷［15－16］。本研究發(fā)現(xiàn)，hTERT在人食管鱗癌EC 9706細胞中不僅存在于細胞核，還定位于線粒體，并在蟾蜍靈誘導(dǎo)的凋亡過程中部分由細胞核向線粒體轉(zhuǎn)位。

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