熊新，周遠(yuǎn)大（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗研究中心，重慶400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，重慶 400016）

白血病細(xì)胞的多藥耐藥（Multidrug resistance，MDR）是指白血病細(xì)胞同時對多種結(jié)構(gòu)和不同作用機(jī)制的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐受，從而使化療失敗或復(fù)發(fā)[1，2]。因此，尋求一種能逆轉(zhuǎn)其MDR的藥物對提高化療效果，延長病人生存期是十分關(guān)鍵的。目前已發(fā)現(xiàn)多種藥物具有逆轉(zhuǎn)MDR的作用，但大多數(shù)逆轉(zhuǎn)藥物當(dāng)達(dá)到其逆轉(zhuǎn)濃度時，其毒副作用明顯[3，4]，從而大大限制了這些逆轉(zhuǎn)藥物的臨床應(yīng)用，近年來研究者們試圖從傳統(tǒng)中醫(yī)藥的角度尋找逆轉(zhuǎn)白血病MDR的新藥[5，6]。

蟾酥是我國傳統(tǒng)的中藥材，有改善全身狀況、提高機(jī)體免疫功能和提升白細(xì)胞等作用，同時還具有一定的抗腫瘤的功效，主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其療效。李貴新等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蟾酥注射液能夠抑制白血病HL60細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討蟾酥注射液逆轉(zhuǎn)耐阿霉素（ADM）的急性髓性白血病細(xì)胞（HL60/ADM）MDR的作用及其機(jī)制，以期為治療白血病提供新的輔助藥物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Shel Lab公司）；全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀（美國Biorad公司）；96孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）；高效液相色譜（HPLC）儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 試藥

蟾酥注射液（江蘇安格藥業(yè)，批號：0001208，濃度：1.65 μg·L－1）；ADM標(biāo)準(zhǔn)品（浙江海正藥業(yè)，批號：H33021980，濃度：100 μg·mL－1）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；MTT（美國Sigma公司）；新生胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈（分析純，上海陸都化學(xué)試劑廠）。

1.3 細(xì)胞株

ADM誘導(dǎo)的人急性髓性白血病耐藥細(xì)胞株HL60/ADM由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HL60/ADM細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度，每2～3 d傳代1次，培養(yǎng)基中加入ADM，使其最終濃度為0.2 μg·mL－1，以維持細(xì)胞的耐藥性，使用前1周停加ADM。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。

2.2 MTT法檢測蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞增殖能力的影響

制備HL60/ADM細(xì)胞懸液（5×104個/mL），并接種于96孔板中，每孔200 μL。分別加入不同濃度蟾酥注射液20 μL（終濃度分別為0.015、0.030、0.060、0.120、0.150 μg·mL－1），每個濃度設(shè)3個平行孔，并設(shè)空白對照。在CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入 5 mg·mL－1MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min使其充分溶解，然后用自動酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A），試驗重復(fù)3次，取平均值。按下式計算細(xì)胞存活率（fu）：fu＝處理組平均A值/對照組平均A值。

2.3 MTT法檢測蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用

試驗分為對照組和處理組，對照組加空白培養(yǎng)液，處理組一次性加逆轉(zhuǎn)濃度的蟾酥注射液誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，并停藥培養(yǎng)7 d，每3 d換液1次。將對照組和處理組細(xì)胞分別制成濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μL。依次加入含不同濃度ADM，每孔20 μL，使ADM的終濃度分別為2.49、4.99、9.96、18.95、39.90 μg·mL－1，每個濃度設(shè)3個平行孔，并設(shè)空白對照組加入等體積培養(yǎng)液。在CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后，同“2.2”項下方法測定各孔A值，試驗重復(fù)3次，取平均值。并計算細(xì)胞抑制率（fa，fa＝1－fu）和半數(shù)抑制量（IC50）。

2.4 HPLC法測定細(xì)胞內(nèi)、外ADM的濃度

2.4.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：5 mmol·L－1；流動相：磷酸-甲醇-異丙醇-乙晴（8∶7∶3∶2）；流速：1 mL·min－1；柱溫：30 ℃；熒光檢測激發(fā)波長：480 nm，發(fā)射波長：560 nm。

在選定的色譜條件下，測得ADM標(biāo)準(zhǔn)品、培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)液中的ADM色譜，被測物與其他雜質(zhì)分離完全，峰形良好，保留時間約為5.8 min。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.ADM標(biāo)準(zhǔn)品；B.空白培養(yǎng)液；C.空白細(xì)胞內(nèi)液；D.培養(yǎng)液中ADM標(biāo)準(zhǔn)品；E.細(xì)胞內(nèi)液中ADM標(biāo)準(zhǔn)品；F.培養(yǎng)液中ADM樣品；G.細(xì)胞內(nèi)液中ADM樣品；1.阿霉素Fig 1 HPLC chromatogramsA.ADM control；B.blank culture medium；C.blank intracelluar fluid；D.ADM control in culture media；E.ADM control in intracelluar fluid；F.ADM in culture media；G.ADM in intracelluar fluid；1.ADM

2.4.2 細(xì)胞樣品處理 試驗分為對照組和處理組，對照組加空白培養(yǎng)液，處理組一次性加逆轉(zhuǎn)濃度的蟾酥注射液誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d，并停藥培養(yǎng)7 d，每3 d換液1次。將對照組和處理組細(xì)胞分別制成濃度為106個/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中，加入ADM使最終濃度為345 μmol·mL－1。在加藥后1、3、6 h分別收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)液，每組3份。取培養(yǎng)上清液或細(xì)胞內(nèi)液0.5 mL，置于1.5 mL離心管中，加入乙腈0.5 mL，快速混勻1 min，超聲振蕩10 min，12 000 r·min－1離心15 min，取上清液10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄峰面積。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 培養(yǎng)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取0.5 mL空白培養(yǎng)液數(shù)份，在ADM標(biāo)準(zhǔn)品粉末中加入不同量蒸餾水，制備濃度為160、80、40、20、10、5 μg·mL－1的ADM培養(yǎng)液樣品各5份，按“2.4.2”項下“取培養(yǎng)上清液”開始操作，進(jìn)行HPLC分析。以培養(yǎng)液中ADM檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝39.649X+3.432 8（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，培養(yǎng)液中ADM檢測濃度在5～160 μg·mL－1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，檢測限為0.1 μg·mL－1（S/N＝5）。培養(yǎng)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 培養(yǎng)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The calibration curves of adriamycin in cell culture media

2.5.2 HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取0.5 mL空白細(xì)胞液數(shù)份，在ADM標(biāo)準(zhǔn)品粉末中加入不同量蒸餾水，制備濃度為160、80、40、20、10、5 μg·mL－1的ADM細(xì)胞樣品各5份，按“2.4.2”項下“取培養(yǎng)上清液”開始操作，進(jìn)行HPLC分析。以HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)液中ADM檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝41.465X－40.751（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)液中ADM檢測濃度在5～160 μg·mL－1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，檢測限為0.1 μg·mL－1（S/N＝3）。HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)液-ADM標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 The calibration curve of adriamycin in HL60/ADM intracellular fluid

2.5.3 精密度與回收率試驗 制備濃度為160、40、5 μg·mL－1的ADM標(biāo)準(zhǔn)品溶液各5份，按“2.4.2”項下“取培養(yǎng)上清液”開始操作，同日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5 d，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，考察方法的精密度與回收率。結(jié)果，平均回收率在98.20%～97.25%范圍內(nèi)，RSD≤1.73%；日內(nèi)、日間RSD均≤2.81%。

2.6 樣品采集

收集HL60/ADM細(xì)胞和處理組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106個/mL，接種10 mL細(xì)胞懸液至100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，2種細(xì)胞分別接種3瓶，加入ADM使最終濃度為200 μg·mL－1。于加藥后1、3、6 h分別收集分離的細(xì)胞和上清液，細(xì)胞用生理鹽水清洗3次，計數(shù)，然后根據(jù)每瓶不同的活細(xì)胞數(shù)量，加入適量的生理鹽水，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個/mL。按反復(fù)凍溶法裂解細(xì)胞，即將細(xì)胞在－20℃以下凍存，室溫溶解，反復(fù)3次，直至細(xì)胞凍溶液中無完整細(xì)胞，離心，取上清液作為細(xì)胞內(nèi)液。取培養(yǎng)上清液或細(xì)胞內(nèi)液0.5 mL，參照“2.4.2”項下“取培養(yǎng)上清液”開始操作，進(jìn)樣測定其ADM濃度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

試驗數(shù)據(jù)采用±s表示，采用Origin 7.5軟件（OriginLab data analysis and graphing software）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異比較采用t檢驗。P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞生長的影響

HL60/ADM細(xì)胞經(jīng)5個濃度梯度的蟾酥注射液處理后，細(xì)胞生長均受到不同程度抑制，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯。選取HL60/ADM細(xì)胞存活率在0.9以上的最大濃度作為蟾酥注射液的逆轉(zhuǎn)劑量，即0.03 μg·mL－1。不同濃度蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞fu的影響見表1。

表1 不同濃度蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞fu的影響（±s，n＝3）Tab 1 Effects of different concentations of Chansu injection on fu of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

表1 不同濃度蟾酥注射液對HL60/ADM細(xì)胞fu的影響（±s，n＝3）Tab 1 Effects of different concentations of Chansu injection on fu of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

指標(biāo)fu藥物濃度/μg·mL－1 0.015 0.976±0.011 0.03 0.916±0.003 0.06 0.781±0.011 0.12 0.618±0.006 0.15 0.418±0.008

3.2 蟾酥注射液逆轉(zhuǎn)作用測定

對照組和處理組的fa均隨著ADM濃度增大而增加。根據(jù)Logit法計算出對照組IC50為19.83 μg·mL－1，處理組的IC50為9.86 μg·L－1，對照組IC50為處理組IC50的1.960 9倍。不同濃度ADM對HL60/ADM細(xì)胞fa的影響見表2。

表2 不同濃度ADM對HL60/ADM細(xì)胞fa的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of adriamycin with different concentrations on fa of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

表2 不同濃度ADM對HL60/ADM細(xì)胞fa的影響（±s，n＝3）Tab 2 Effects of adriamycin with different concentrations on fa of HL60/ADM cell（±s，n＝3）

與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01

組別對照組處理組藥物濃度/μg·mL－1 39.90 69.75±0.97 90.17±1.05＊2.49 6.31±1.04 6.45±1.12 4.99 12.25±0.88 33.40±5.76＊9.96 35.16±1.01 54.62±0.39＊18.95 49.66±8.54 70.27±2.67＊

圖4 樣品培養(yǎng)液、細(xì)胞中ADM含量測定結(jié)果A.樣品培養(yǎng)液；B.細(xì)胞內(nèi)液與對照組比較：＊P＜0.01Fig 4 Content determination of sample medium and intracelluar adriamycinA.sample culture medium；B.intracelluar fluid vs.control group：＊P＜0.01

3.3 HPLC法測定細(xì)胞內(nèi)、外ADM的濃度

分別取對照組和處理組在不同時間點（1、3、6 h）的樣品溶液各0.2 mL，每組3份，按“2.4.2”項下“取培養(yǎng)上清液”開始操作，進(jìn)樣50 μL做HPLC分析，比較各組細(xì)胞內(nèi)、外ADM的含量。隨著時間的延長，處理組中進(jìn)入HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)的ADM逐漸增加，而HL60/ADM培養(yǎng)液中ADM藥物濃度逐漸減少，表明蟾酥注射液能夠增強耐藥細(xì)胞攝取ADM的能力，與對照組細(xì)胞內(nèi)ADM濃度比較有顯著性差異（P＜0.01）。樣品培養(yǎng)液、細(xì)胞中ADM含量測定結(jié)果見圖4。

4 討論

化療是白血病治療的主要手段，即使是各種異基因和自體造血干細(xì)胞移植，其療效前提仍要求腫瘤細(xì)胞對放療、化療敏感，而MDR的產(chǎn)生卻嚴(yán)重影響了白血病化療的療效，是造成白血病復(fù)發(fā)和難治的主要原因。MDR產(chǎn)生的原因十分復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果，目前研究得較多的是生化耐藥和凋亡耐藥。生化耐藥指腫瘤細(xì)胞的遺傳性及生化特性發(fā)生變化，致使細(xì)胞通過不同途徑對藥物產(chǎn)生耐藥性，以腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低為特征；凋亡耐藥是指腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強，對藥物的敏感性降低。尋求一種有效的MDR逆轉(zhuǎn)藥物對提高白血病化療效果十分關(guān)鍵。

本研究通過細(xì)胞毒性試驗發(fā)現(xiàn)，蟾酥注射液能明顯抑制HL60/ADM細(xì)胞的生長，且存在劑量依賴性，隨著蟾酥注射液濃度的升高，HL60/ADM細(xì)胞fu逐漸減少，這說明蟾酥注射液是一種有效的腫瘤抑制藥物。筆者選取fu＞0.9的最大濃度即非細(xì)胞毒性劑量濃度（0.03 μg·mL－1）作為誘導(dǎo)細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)劑量。進(jìn)行體外試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，ADM對HL60/ADM細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強（P＜0.05），蟾酥注射液能部分逆轉(zhuǎn)HL60/ADM細(xì)胞對ADM的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.960 9倍。這些研究結(jié)果初步表明，蟾酥注射液可能既是一種有效的抗腫瘤藥物，又是一種耐藥逆轉(zhuǎn)藥物。因此，當(dāng)與化療藥物聯(lián)合進(jìn)行白血病化療時，一方面可以通過自身的抗腫瘤作用抑制白血病細(xì)胞的生長；另一方面還可以通過逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的耐藥性，提高其對化療藥物的敏感性，從而減小化療藥物的劑量，降低對機(jī)體的毒副作用。

MDR的逆轉(zhuǎn)機(jī)制是十分復(fù)雜的，其中一個主要途徑可能是通過下調(diào)細(xì)胞膜糖蛋白P170的表達(dá)，使其將化療藥物泵出細(xì)胞外的功能受到抑制，從而使化療藥物在白血病細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效濃度，從而抑制白血病細(xì)胞的生長[8，9]。本研究采用HPLC法測定HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)、外的ADM濃度，結(jié)果顯示在1、3、6 h經(jīng)蟾酥注射液處理的HL60/ADM細(xì)胞內(nèi)ADM含量，均較未經(jīng)處理的細(xì)胞內(nèi)ADM含量高，且隨時間延長濃度增加更明顯，而培養(yǎng)液中ADM含量則相反。提示蟾酥注射液可通過增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度來逆轉(zhuǎn)HL60/ADM對ADM的耐藥作用，機(jī)制可能與細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運泵有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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