鄧茂芝，趙常軍，彭雪芬，楊建春（.江西宜春市食品藥品檢驗(yàn)所，江西宜春336000；.江西宜春市第六人民醫(yī)院，江西宜春 336000）

熊膽丸是由龍膽、黃連、大黃、梔子、冰片、薄荷腦、熊膽等16味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱散風(fēng)、止痛退翳之功效。用于治療風(fēng)熱或肝經(jīng)濕熱引起的目赤腫痛、羞明多淚等證。收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第2冊(cè)[1]。在日常藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中，常常會(huì)發(fā)現(xiàn)該藥內(nèi)容物凝結(jié)成柱狀或團(tuán)塊狀，按標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)僅有性狀、檢查2項(xiàng)常規(guī)項(xiàng)目，而無(wú)其他檢驗(yàn)項(xiàng)目，因而不能有效監(jiān)控該制劑內(nèi)在質(zhì)量。

為進(jìn)一步加強(qiáng)該品種的質(zhì)控，并根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃中中成藥品種增修訂項(xiàng)目任務(wù)表的要求，筆者在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了熊膽、龍膽、梔子、黃連的薄層色譜（TLC）鑒別以及冰片、薄荷腦的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

7890A氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；BP211D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；KG-250DB超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

熊去氧膽酸（批號(hào)：732-8702）、鵝去氧膽酸（批號(hào)：806-9101）、龍膽苦苷（批號(hào)：110770-200308）、梔子苷（批號(hào)：110749-200511）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-200208）、冰片（批號(hào)：110743-200905）、薄荷腦（批號(hào)：110728-200506）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；熊膽丸共15批次，均從本轄區(qū)內(nèi)醫(yī)藥批發(fā)、零售藥店抽驗(yàn)而來(lái)，批號(hào)為20081101、071201039、20090501、090917、20080501、20070901、071030、20080601、20081003、20070503、080303030、090211、090603、090901122、090501200；制劑中各藥材均為市售品，由江西省宜春市食品藥品檢驗(yàn)所鄢愛勇副主任中藥師鑒定為真品；硅膠G、GF254（青島海洋化工有限公司）；甲醇、三氯甲烷、石油醚（30～60℃）、乙酸乙酯、冰醋酸、乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、水楊酸甲酯、無(wú)水乙醇均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 熊膽的TLC鑒別[2～9]

取本品20粒內(nèi)容物，加甲醇25 mL，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取20 min，過(guò)濾，水浴蒸干，殘?jiān)?0%氫氧化鈉溶液15 mL，置120～140℃的液體石蠟浴中加熱回流7 h，放冷，加鹽酸調(diào)pH值為2～3，加水10 mL，搖勻，用三氯甲烷提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；取處方中不含熊膽的其他藥材按制備方法制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；取熊去氧膽酸對(duì)照品、鵝去氧膽酸對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；另取供試品溶液及對(duì)照品溶液按1∶1混合，搖勻，制得陽(yáng)性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各4～7μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶4∶2.5∶2.5）為展開劑，展開，展距約13 cm，取出，晾干；再以上述展開劑展開1次，展距13 cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，分別在日光、紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與2種對(duì)照品及陽(yáng)性對(duì)照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。熊膽的TLC見圖1。

圖1 熊膽的TLCA.日光檢視；B.紫外光燈（365 nm）檢視；1～3.供試品；4.熊去氧膽酸對(duì)照品；5.鵝去氧膽酸對(duì)照品；6.陽(yáng)性對(duì)照；7.缺熊膽陰性對(duì)照Fig 1 TLC of bear gallA.under sunlight；B.under uvligh（t365 nm）；1～3.test samples；4.ursodeoxycholic acid control；5.chenodeoxycholic acid control；6.positive control；7.negative control without bear gall

2.2 黃連的TLC鑒別[10]

取本品4粒內(nèi)容物，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，棄去乙醚液，殘?jiān)蛹状?0 mL，回流提取30 min，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL，作為供試品溶液；另取處方中缺黃連的其他藥材按制備工藝制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2～5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇-氨水（30∶2∶5∶7）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。黃連的TLC見圖2。

2.3 龍膽、梔子的TLC鑒別[11～15]

取本品10粒內(nèi)容物，加石油醚20 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，棄去濾液，藥渣加甲醇20 mL，回流2 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約3 mL，加中性氧化鋁（100～200目）9 g攪勻，蒸干，置層析柱（內(nèi)徑1.5 cm）上，用甲醇洗脫至洗脫液無(wú)色，洗脫液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液；另取處方中分別缺龍膽、梔子的其他藥材按制備工藝分別制成陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液；取龍膽苦苷、梔子苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述5種溶液各2～5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（20∶1∶0.5）為展開劑，展距13 cm，取出，晾干，再以上述展開劑展開3次，展距13 cm，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視；再噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。龍膽、梔子的TLC見圖3。

圖2 黃連的TLC1、5.鹽酸小檗堿對(duì)照品；2～4.供試品；6.缺黃連陰性對(duì)照溶液Fig 2 TLC of Coptidis Rhizoma1，5.berberine hydrochloride control；2～4.test samples；6.negative control without Coptidis Rhizoma

圖3 龍膽、梔子的TLCA.紫外光燈（254 nm）檢視；B.日光檢視；1.缺龍膽陰性對(duì)照；2.缺梔子陰性對(duì)照；3～5.供試品；6.龍膽苦苷對(duì)照品；7.梔子苷對(duì)照品Fig 3 TLC of Gentianae Radix Et Rhizoma and Gardenia jasminoidesA.under uvlight（254 nm）；B.under sunlight；1.negative control without Gentianae Radix Et Rhizoma；2.negative control without G.jasminoides；3～5.test samples；6.gentiopicrin control；7.jasminoidin control

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[16～18]

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.45 mm×0.85μm）；檢測(cè)器溫度：300℃；進(jìn)樣口溫度：240℃；柱溫：130℃；載氣：高純氮?dú)猓惠d氣流速：3.0 mL·min-1；分流比：25∶1；進(jìn)樣量：1.0μL。在此色譜條件下薄荷腦、冰片（以異龍腦、龍腦計(jì)）、水楊酸甲酯色譜峰均能有效分離，在薄荷腦、冰片色譜峰相同位置處無(wú)色譜峰出現(xiàn)。色譜見圖4。

圖4 氣相色譜圖A.供試品；B.內(nèi)標(biāo)；C.陰性對(duì)照；D.混合對(duì)照品；1.薄荷腦；2.異龍腦；3.龍腦；4.水楊酸甲酯Fig 4 GC chromatogramsA.test sample；B.internal standard；C.negative control；D.mixture control；1.menthol；2.isoborneol；3.borneol；4.methyl salicylate

3.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取水楊酸甲酯適量，加無(wú)水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

3.3 混合對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取冰片對(duì)照品28.57 mg，薄荷腦對(duì)照品28.47 mg，置25 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品貯備液。

3.4 供試品溶液的制備

取本品0.5 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液25 mL，稱定重量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，取出，放冷，補(bǔ)足失重，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成一系列濃度的對(duì)照品溶液，分別精密吸取1.0μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（X）為橫坐標(biāo)，檢測(cè)濃度（Y）為縱坐標(biāo)，分別制備冰片、薄荷腦的回歸方程。結(jié)果，冰片、薄荷腦的回歸方程分別為Y＝0.355 9X+0.010 7（r＝0.998 7，n＝7）、Y＝0.360 0X+0.008 4（r＝0.998 4，n＝7），表明冰片、薄荷腦的檢測(cè)濃度分別在56.9～683.3、56.0～672.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與對(duì)照品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值呈良好線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液1.0μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定薄荷腦、冰片峰面積，計(jì)算其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。結(jié)果，RSD分別為2.1%、1.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定薄荷腦、冰片峰面積，計(jì)算其與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。結(jié)果，RSD分別為0.9%、0.9%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品適量，共6份，分別按“3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定薄荷腦、冰片峰面積，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果，薄荷腦、冰片含量分別為6.70、7.25 mg/粒，RSD分別為1.10%，1.26%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（冰片：5.10 mg/粒，薄荷腦：5.32 mg/粒）的樣品9份，分為3組（樣品中冰片的量為1.3、2.5、3.8 mg，薄荷腦的量為1.3、2.6、3.9 mg），每組分別精密加入含冰片（1.220 3 mg·mL-1）、薄荷腦（1.301 2 mg·mL-1）的混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0 mL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，冰片的平均回收率為98.68%，RSD＝1.1%（n＝9）；薄荷腦的平均回收率為99.07%，RSD＝1.0%（n＝9）。

3.10 樣品含量測(cè)定

按所建立的方法，對(duì)15個(gè)批次（依次為序號(hào)1到15）的樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/粒，n＝5）Tab 1 Results of content determination of samples（mg/piece，n＝5）

4 討論

為有效提取制劑中的冰片、薄荷腦，筆者對(duì)回流和超聲這2種常用的方法進(jìn)行了比較，溶劑采用易溶解冰片的無(wú)水乙醇。結(jié)果顯示，采用回流方法進(jìn)行提取時(shí)，含量略高于超聲提取，但無(wú)顯著差異。為保證方法的耐用性，從節(jié)約能源、操作簡(jiǎn)便的角度考慮，采用超聲30 min作為提取方法。

由于梔子苷、龍膽苦苷均為環(huán)烯醚萜類，性質(zhì)相似，故試驗(yàn)中單獨(dú)做龍膽、梔子TLC鑒別時(shí)，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照疑似有干擾成分，不能達(dá)到良好分離效果。而采用3次展開，同時(shí)檢測(cè)2種成分的方法分離效果良好。

因已知冰片、薄荷腦具揮發(fā)性，在常溫下不穩(wěn)定，在生產(chǎn)過(guò)程中易損失，因此含量測(cè)定選用冰片、薄荷腦為指標(biāo)。冰片對(duì)照品中含龍腦、異龍腦2種成分，含量測(cè)定是以2種成分之和為指標(biāo)。

樣品含量測(cè)定結(jié)果表明，不同廠家熊膽丸中薄荷腦、冰片的含量差值較大，薄荷腦含量最高與最低相差70倍，冰片的含量則相差26倍，這可能與工藝、原料質(zhì)量有關(guān)。筆者還發(fā)現(xiàn)，有的批次甚至未檢出相關(guān)成分，其膠囊內(nèi)容物亦無(wú)薄荷或冰片樣氣味。有效成分偏低，必將影響治療效果，應(yīng)當(dāng)引起重視。根據(jù)處方及測(cè)定結(jié)果，建議薄荷腦、龍腦含量均不低于4.0 mg/粒。

[1]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第2冊(cè)）[S].1990：291.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[3]王 蘭.熊膽與其偽造品的鑒別[J].吉林中醫(yī)藥，2003，23（12）：49.

[4]陳 潔，王亮明，徐成銀.貝芪口服液中牛磺熊去氧膽酸的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)，2000，20（5）：269.

[5]趙 勇，昝麗霞，孫文基.HPLC-ELSD法測(cè)定熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（1）：127.

[6]陸 妙.RP-HPLC法測(cè)定熊去氧膽酸膠囊中熊去氧膽酸的含量[J].中國(guó)藥房，2008，19（30）：2 384.

[7]石 宏，崔明淑，全仙花.薄層掃描法測(cè)定復(fù)方熊膽乙肝膠囊中熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量[J].吉林中醫(yī)藥，2002，22（2）：59.

[8]王守箐.HPLC-ELSD測(cè)定雙膽痔瘡栓中熊去氧膽酸含量[J].藥物分析雜志，2005，25（6）：722.

[9]池述廣.熊膽主要化學(xué)成分合成方法及藥理研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2008，20（2）：5.

[10]呂武清，龍新華.中成藥中的藥材薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：476.

[11]趙瑞芝，梁偉杰，丘小惠.龍膽藥材中龍膽苦苷的提取工藝研究[J].中國(guó)藥房，2005，16（12）：956.

[12]郭海風(fēng)，樸患順.龍膽苦苷的提取工藝及藥理作用研究進(jìn)展[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（1）：70.

[13]趙 勇，張 儒，孫文基.大孔吸附樹脂富集秦艽葉中龍膽苦苷的工藝研究[J].中藥材，2007，30（12）：1 583.

[14]許有威，齊 艷，韓 旭，等.高效逆流色譜結(jié)合大孔樹脂從龍膽中快速分離高純度龍膽苦苷[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32（24）：2 595.

[15]劉 靜，王美英.清肝合劑的薄層色譜鑒別[J].中國(guó)藥師，2008，11（1）：116.

[16]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件匯編（2003－2008）[Z].2009：187-189.

[17]簡(jiǎn)柳清，曾赟昀，劉聲波，等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定止咳枇杷顆粒中薄荷腦的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（2）：167.

[18]唐 杰，陳玉誼.氣相色譜法測(cè)定市售復(fù)方丹參片中冰片的含量[J].海峽藥學(xué)，2008，20（8）：62.