宋 潔 孫 凱 張書捷 魯 雙 李翠萍 韓彥龍 卜曉波

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物教研室，黑龍江 牡丹江 157000)

中國各地區(qū)高血壓患病率總體上是北高南低，由東北向西南遞減，且原發(fā)性高血壓在不同民族中的發(fā)病率不同，提示遺傳背景與高血壓患病存在著一定的聯(lián)系〔1〕。緩激肽(BK)是重要的血管活性物質(zhì)之一，通過緩激肽β2受體(bradykinin receptorβ2，BKβ2R)介導(dǎo)發(fā)揮作用。朝鮮族人群高血壓的發(fā)病率居全國56個民族前列，中國牡丹江地區(qū)為心血管疾病高發(fā)區(qū)并為朝鮮族人群聚居區(qū)。本研究以BKβ2R為候選基因，探討其多態(tài)位點與朝鮮族原發(fā)性高血壓的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 樣本采集 高血壓組取自2008～2011年于牡丹江市朝鮮民族醫(yī)院內(nèi)科就診的原發(fā)性高血壓患者，均為世居牡丹江的朝鮮族人群，三代血親內(nèi)無其他民族。符合1999年《WHO/ISH1999高血壓指南》制定的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕，且排除糖尿病、冠狀動脈硬化性心臟病、腎衰竭和繼發(fā)性高血壓者。共納入313例患者，年齡 (58.7±9.2)歲，血壓145.9/100.7 mmHg。

正常對照組取自2008年于牡丹江市朝鮮民族醫(yī)院門診體檢的健康人，無高血壓病家族史，體格檢查及常規(guī)化驗未見異常，共納入202名，年齡 (56，4±10.2)歲，血壓115.3/77.1 mmHg。各組受試者均無血緣關(guān)系，均了解實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容，并自愿參加實驗。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA的提取 取凍存乙二胺四乙酸 (EDTA)抗凝靜脈血全血300 μl，用杭州博訊公司的DNA提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆?。參照Braun等〔3〕設(shè)計，委托上海生工生物工程公司合成引物，上游:5′－GCAGAGCTCAGCTGGAGGCG－3′， 下 游:5′－CCTCCTCGGAGCCCAGAAG－3′。PCR 反應(yīng)體系為 25 μl，其中模板 DNA 50 ng(1 μl)，引物各10 pmol/L(各 1 μl)，2 × TaqMiX 12.5 μl:MgCl2終濃度為2 mmol/L、Taq酶0.6 U、dNTP為0.2 mmol/L，雙蒸水9.5 μl，反應(yīng)混合物混勻后瞬間離心，94℃預(yù)變性5 min，繼之32個循環(huán)，每個周期94℃變性60 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸60 s，末次循環(huán)后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.2 單鏈構(gòu)向多態(tài)性(single strain conformation polymorphism，SSCP) 取10 μl PCR產(chǎn)物加入5倍體積的變性液，煮沸變性10 min后立即冰浴。上樣于20%非變性聚丙烯酰胺凝膠(電泳緩沖液為2×TBE)，進(jìn)行室溫，恒功率3 W 電泳20～24 h，電泳結(jié)束后，凝膠進(jìn)行硝酸銀染色并拍照分析。

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序分析 對SSCP中檢測到的不同帶形的樣本進(jìn)行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物克隆，菌液送北京恒博和泰生物科技公司進(jìn)行測序，確定為胸腺嘧啶(T)還是腺嘌呤(C)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SSCP13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，經(jīng)Hardy－Wenberg遺傳平衡定律檢驗各基因型和等位基因分布頻率已達(dá)遺傳平衡，基因型和等位基因頻率在各組間的比較采用χ2檢驗，一般項目比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組與對照組一般資料比較 兩組年齡、性別差異均無顯著性意義(P＞0.05)。高血壓組的體質(zhì)量指數(shù)及血壓均明顯大于正常對照組(P＜0.01)，在生化指標(biāo)中，高血壓組的總膽固醇明顯高于正常組(P＜0.05)，而血糖和血脂含量在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 PCR－SSCP電泳及測序結(jié)果 高血壓患者和正常組的DNA標(biāo)本經(jīng)PCR擴增，得到產(chǎn)物為122 bp的片段。經(jīng)SSCP分析，產(chǎn)生3種基因型CC型純合子、TT型純合子和CT型雜合子，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆及測序證實存在T－C置換。見圖1，圖2。

2.3 牡丹江地區(qū)人群BKβ2R基因－58T/C基因型和等位基因的分布 在牡丹江地區(qū)，BKβ2R基因 －58T/C多態(tài)性 TT、CT、CC基因型分布在高血壓人群和正常人群間差異無顯著性意義(P＞0.05)。T，C等位基因頻率在高血壓人群和正常人群間差異也無顯著性意義(P＞0.05)。見表2。

表1 高血壓組與對照組臨床指標(biāo)比較(±s)

表1 高血壓組與對照組臨床指標(biāo)比較(±s)

313 202年齡 58.7±9.2 56.4±10.6男/女(n) 160/153 103/99體重指數(shù)(BMI，kg/m2) 26.4±4.27 22.8±3.79收縮壓(SBP，mmHg) 145.9 ± 16.94 115.3±10.2舒張壓(DBP，mmHg) 100.7± 11.3 77.1±9.58總膽固醇(mmol/L) 5.4±1.12 4.78±0.58甘油三酯(mmol/L) 2.25±1.34 2.19±1.06血糖(mmol/L)n 5.01±1.56 4.98±1.71指標(biāo) 高血壓組 正常對照組

表2 BKβ2R基因－58T/C突變基因型及其等位基因頻率在牡丹江地區(qū)人群中的分布〔n(%)〕

圖1 BKβ2R基因啟動子區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2 PCR擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果

3 討論

BK是迄今發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強的血管舒張物質(zhì)之一，直接擴張血管，對抗血管緊張素、去甲腎上腺素的縮血管作用，促進(jìn)內(nèi)源性舒血管物質(zhì)的產(chǎn)生，其生理作用主要是通過存在于絕大部分組織器官β2受體介導(dǎo)的。BKβ2R屬于G蛋白耦聯(lián)受體，相對分子質(zhì)量41696 Da，基因位于染色體14q32.2，含有3個外顯子，編碼364位氨基酸。1995年 Braun等〔3〕對人類 BKβ2R基因多態(tài)性位點的研究證實3個外顯子和1個啟動子區(qū)存在4種多態(tài)性。1999年Madeddu等〔4〕在對人類轉(zhuǎn)BK受體基因鼠和BK受體基因敲除鼠大動脈內(nèi)注射BK實驗中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠血壓明顯降低，而基因敲除鼠無明顯變化，提示 BK和BKβ2R在血壓表型中具有重要作用。

關(guān)于BKβ2R基因多態(tài)與原發(fā)性高血壓相關(guān)性研究報道主要集中在 BKβ2R基因啟動子區(qū) －58位 T/C多態(tài)的研究。Mukae等〔5〕對日本，Gainer等〔6〕對非洲裔美國，王兵等〔7〕對中國漢族的高血壓和正常血壓人群基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)在高血壓患者中啟動子區(qū)－58等位基因的差異明顯，高血壓患者組中CC基因型和C等位基因分布頻率明顯高于正常對照組。但是在朝鮮族人群研究還未見報道。朝鮮族人具有獨特的生活方式如高飲酒，高鹽飲食(腌菜、泡菜)等，為高血壓患病的高危環(huán)境因素，導(dǎo)致朝鮮族為我國56個少數(shù)民族中高血壓患病率最高的四個民族之一。因此在牡丹江地區(qū)開展朝鮮族人群原發(fā)性高血壓分子遺傳學(xué)研究具有重要意義。通過實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)中國牡丹江地區(qū)朝鮮族原發(fā)性高血壓患者CC、CT、TT;C、T基因型頻率及基因頻率與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，C、T等位與正常對照組有差異統(tǒng)計學(xué)意義，說明BKβ2R基因啟動子區(qū)－58位T/C多態(tài)性與中國牡丹江地區(qū)朝鮮族人原發(fā)性高血壓可能無關(guān)，這與對北愛爾蘭和法國人群的多中心病例對照(ECTIM)研究、中國新疆哈薩克族人群〔8，9〕和原發(fā)性高血壓患者的研究結(jié)果一致，而與日本、非洲裔美國人及中國漢族人群的研究結(jié)果不一致。

在本研究中C等位基因頻率在高血壓組為0.487，低于以往報道亞洲日本人群C基因頻率是0.575，非洲裔美國人C基因頻率分別是0.62，中國漢族人群等位基因C為0.58。但高于新疆哈薩克族人群0.47，反映了不同種族基因型頻率存在差異。Madeddu等的研究發(fā)現(xiàn)BKβ2R基因敲除鼠的鹽敏感性增加，德國科學(xué)家Braun等〔10〕發(fā)現(xiàn)－58T等位基因轉(zhuǎn)錄效率較－58C略高，提示啟動子區(qū)－58C等位基因型降低BKβ2R基因轉(zhuǎn)錄效率導(dǎo)致高血壓。BKβ2R基因啟動子區(qū)－58C/T多態(tài)性雖然在朝鮮族原發(fā)性高血壓人群和正常的朝鮮族人群的頻率無顯著差異，但是－58C等位基因的低頻率的數(shù)據(jù)顯示了朝鮮族群體的高血壓的高危遺傳因素。雖然本文選擇的研究對象為無異族通婚的牡丹江地區(qū)朝鮮族人群，并嚴(yán)格限定了入選標(biāo)準(zhǔn)，所選樣本具有群體代表性。但在朝鮮族高血壓人群中的作用需在不同地區(qū)加大樣本做大量的調(diào)查檢測。

綜上，BKβ2R基因啟動子區(qū)－58位T/C多態(tài)性與中國牡丹江地區(qū)朝鮮族人原發(fā)性高血壓無關(guān)，不是朝鮮族原發(fā)性高血壓的主要遺傳因素?？梢姡蚨鄳B(tài)性與原發(fā)性高血壓相關(guān)性具有種族、民族特征，不同人群的原發(fā)性高血壓遺傳背景也不盡相同。

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