喻 陸 史春夏(解放軍305醫(yī)院，北京 0007)

線粒體DNA(mtDNA)損傷學說認為衰老是因為機體組織線粒體缺乏DNA損傷修復機制，從而導致mtDNA氧化損傷累積所致，主要是mtDNA缺失突變引起線粒體氧化磷酸化功能受損，導致能量產(chǎn)出缺陷、衰老、死亡〔1〕。國內(nèi)外研究表明，哺乳動物mtDNA損傷隨增齡積累，且與生物衰老之間存在高度的相關性〔2〕。松花粉藥名松黃，是一種營養(yǎng)價值高、藥理作用廣的中藥，我實驗室前期的研究顯示松花粉具有較好的抗成纖維細胞衰老的作用〔3〕，因此本次實驗研究松花粉對衰老成纖維細胞mtDNA缺失突變的影響，以期進一步闡釋松花粉延緩細胞衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)、分組與處理 人胚肺2BS細胞由北京生物制品研究所建株，28代引入。培養(yǎng)于15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中生長。體外培養(yǎng)最多可分裂60～70代。一般認為30代以下為年輕細胞，55代以上為衰老細胞。至30代時隨機取8瓶作為年青對照組，至56代時隨機取16瓶分成衰老組、松花粉組，每組 8瓶。參照文獻〔4〕配制松花粉血清液，使其終濃為240 mg/dl(松花粉處理組);對照組分為青年組、衰老組。松花粉組從28代起使用松花粉血清液連續(xù)培養(yǎng)2BS細胞;對照組從28代起連續(xù)培養(yǎng)，采用對照培養(yǎng)基(同體積DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)。當細胞融合度約90%時，按1∶2或1∶4傳代，細胞傳代后如3周內(nèi)不能融合，則停止傳代。

1.2 儀器與試劑 松花粉由中國林業(yè)學院亞熱帶林業(yè)研究所提供，為天然破壁松花粉。PCR儀(美國Perkin-Elmer公司，9600型);凝膠成像儀(Bio-Rad)。類標準胎牛血清(FBS)購自民海生物，DMEM培養(yǎng)基(含非必需氨基酸、谷胺酰胺)為Invitrogen產(chǎn)品。細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(β-gal)染色試劑盒(上海杰美)。mtDNA試劑盒，購于上海生物工程研究中心。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 細胞形態(tài)觀察及單細胞面積測定 各組細胞相差顯微鏡下觀察形態(tài)改變(×400)。

1.3.2 β-gal染色 將成纖維細胞接種于蓋玻片上。在松花粉作用于不同時間后，PBS洗一次，用40 g/L多聚甲醛固定細胞45 min，用X-半乳糖苷酶(X-gal)染液，37℃保溫4～8 h。染液含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸鈉(pH6.0)、5 mmol/L鐵氰化鉀、5 mmol/L亞鐵氰化鉀、150 mmol/L氯化鈉、2 mmol/L氯化鎂。室溫顯色過夜。衰老細胞呈深藍色，顯微鏡下計數(shù)。

1.3.3 RT-PCR法檢測mtDNA4977的表達 mtDNA4977基因的引物由上海生工合成，基因序列參照文獻〔5，6〕設計，檢測mtDNA4977缺失后線粒體DNA-loop區(qū)引物序列為上游引物:5'-CCC TTA AAT AAG ACA TCA CGA TG-3';下游引物:5'-GTT AGTTGG GGG GTG ACT GT-3'，跨越468 bp的片段。參考文獻〔4，5〕本研究同時采用總mtDNA一段保守序列擴增作為內(nèi)參，上游引物5'-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3'，下游引物為 3'-CCTTTTTCTGATAGGCGGG-5'，長度 700 bp，用于代表mtDNA的總量，由上海生工合成。mtDNA提取與測定:采用mtDNA抽提試劑盒提取細胞總mtDNA。紫外分光光度計測定其吸光度值并計算mtDNA濃度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段完整性。PCR擴增:反應體系為50 μl，mtDNA量約2 μl(50 ng)，引物各0.5 μl(內(nèi)參和目的基因引物各25 pmol)，dNTPS 5.0 μl(200 μmol/L)，10 × Buffer 5.0 μl，加 ddH2O 至總體積49 μl，將除Taq酶以外所有反應成分加入0.5 ml小離心管中，覆蓋石蠟40 μl，短暫離心，94℃預變性2 min，加入Taq酶1 μl(2.5 U)，進入如下循環(huán):94℃ 30 s→ 56℃ 30 s→72℃30 s，共30個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物鑒定及分析:取PCR產(chǎn)物8 μl，在含EB終濃度為0.5 μg/ml的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠分析系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行掃描定量分析。PCR產(chǎn)物分析軟件對各電泳條帶得出各PCR產(chǎn)物的平均灰度值。用DNA4977片段缺失后擴增的468 bp灰度值與內(nèi)參片段灰度值的比值代表缺失突變線粒體DNA 在總線粒體 DNA 中的相對比例〔5，6〕。

1.3.4 細胞SOD活性、MDA含量測定 分別收集各組細胞，反復凍融細胞，使細胞脹破，離心取上清液，按試劑盒說明書中的方法測定血清中的SOD活性、MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞形態(tài)學變化 觀察發(fā)現(xiàn)年青細胞平均兩天呈致密單層，細胞長梭形，排列成束狀，界限清晰，細胞飽滿，折光度好，立體感強;衰老細胞形成單層時間延長，邊緣不整齊，排列紊亂，折光度下降，可呈棱形、三角形，表面有微小泡狀突起，胞質(zhì)內(nèi)有顆粒樣物聚集;用松花粉老年細胞，細胞長梭形，邊緣整齊，排列成束狀，折光度好，立體感強。見圖1。

2.2 衰老相關β-gal檢測 細胞固定后用X-gal染色測其βgal活性，細胞呈深藍色的為衰老細胞(圖2)。實驗發(fā)現(xiàn)，β-gal染色陽性細胞百分比在青年組為(8.42±3.58)%，衰老組為(89.42±5.28)%，240 mg/dl松花粉組為(18.22±8.28)%。衰老組較青年組顯著增高(P＜0.001)，松花粉組均較衰老組顯著降低(P＜0.001)。結(jié)果表明，松花粉可以抑制組織細胞衰老，延長細胞壽命。

圖1 各組細胞形態(tài)圖(×400)

圖2 細胞衰老相關β-gal染色圖(×100)

2.3 各組細胞SOD、MDA含量測定結(jié)果 衰老組細胞SOD明顯低于青年組(P＜0.05)，而MDA含量明顯高于青年組(P＜0.05);松花粉組細胞SOD活性明顯高于衰老組(P＜0.05)，而MDA含量明顯低于衰老組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組細胞SOD活性、MDA含量(±s，n=8)

表1 各組細胞SOD活性、MDA含量(±s，n=8)

與青年組比較:1)P＜0.05，與衰老組比較:2)P＜0.05

組別 SOD活性(U/ml) MDA含量(nmol/ml)39.68±4.87 19.36±3.4衰老組 15.27±3.111) 44.71±3.71)松花粉組 37.69±4.212) 21.34±4.72)青年組

2.4 PCR結(jié)果

2.4.1 線粒體總DNA完整性分析 各組DNA的提取后的線粒體DNA，產(chǎn)物在紫外燈下OD260進行比色分析計算含量，OD260/OD280在1.8～2.0之間說明純度較好。線粒體DNA的全長16 kb，通過瓊脂糖電泳可以看見抽提的線粒體總DNA，片段完整，無蛋白質(zhì)污染，可用于RT-PCR反應。見圖3。

2.4.2 mtDNA4977的電泳表達結(jié)果 各組均呈現(xiàn)2條清晰的條帶，700 bp為內(nèi)參片段，468 bp為mtDNA D-loop區(qū)片段。通過軟件分析mtDNA4977/內(nèi)參作為半定量結(jié)果，衰老細胞組缺失突變(28.689 4)在mtDNA中的比例均顯著高于另外兩組(均P＜0.05)，是青年細胞組的6.21倍(4.615 2)，而衰老細胞組缺失突變(28.689 4)在mtDNA中的比例是松花粉處理組的2.55倍(11.263 5)。見圖4。

圖3 總DNA完整性分析

圖4 mtDNA4977基因RT-PCR電泳圖

3 討論

自1989年Limrane等提出線粒體衰老假說以來，人們越來越關注線粒體與衰老的關系。隨著衰老的進程，有絲分裂后組織中mtDNA缺失和點突變隨之出現(xiàn)〔7〕，而且在老年個體中達到高水平，尤其在負責mtDNA復制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域突變尤為明顯，mtDNA突變的增加加速了衰老進程〔8〕。Jou等〔9〕的研究結(jié)果也證實mtDNA的缺失突變與衰老的相關性。

目前認為mtDNA突變隨增齡積累是導致衰老的重要因素之一，而活性氧(ROS)損傷是衰老時mtDNA突變的主要原因。衰老時常見的mtDNA突變有三種:①缺失突變;②點突變;③重排。其中mtDNA缺失突變研究最多，發(fā)生頻率也最高，與衰老及疾病的關系較為密切。較常見的與衰老相關的缺失突變則是4 977 bp～5 kb片段的缺失，在心、骨骼肌和腎等各臟器中均可找到該突變，稱之為“共有缺失”。mtDNA是位于線粒體基質(zhì)內(nèi)的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，線粒體mtDNA基因排列緊湊，無內(nèi)含子，部分區(qū)域出現(xiàn)基因的重疊，幾乎每個堿基都用于基因組建。因此任何突變都會累及到基因組中的一個重要功能區(qū)域，最終導致氧化磷酸化功能受損導致能量產(chǎn)出缺陷、衰老和細胞死亡。

缺失mtDNA損傷類型以片段缺失最普通，mtDNA突變隨年齡的增長而增多，使mtDNA基因組高突變率常作為衰老過程的潛力生物學標記〔10〕。目前認為mtDNA缺失隨增齡的積累是衰老的重要因素之一，已有大量研究證實人類或動物的各種組織細胞中mtDNA缺失均隨增齡而增加，其中4 977 bp缺失在人體中研究最多。Gerhard等〔11〕用PCR方法在胎兒、青年、老年三個年齡組的皮膚成纖維 細胞都檢測到4 977 bp缺失，其中老年組最高，大于0.3%。Barron等〔12〕同樣用 PCR方法在14～94歲人的黃斑中檢測到4 977 bp缺失漸進性積累，其中60～94歲缺失增加顯著，從0.25%～5.39%。

mtDNA由于其損傷修復系統(tǒng)有限，本身的拓撲結(jié)構(gòu)又位于線粒體內(nèi)膜附近，裸露于內(nèi)膜氧化呼吸鏈產(chǎn)生的大量自由基環(huán)境中，易遭受氧化損傷。因此mtDNA突變率是核基因的10～20倍，可使mtDNA發(fā)生大片段的缺失突變。因長期遭受自由基的攻擊，導致哺乳動物mtDNA具有極高的突變率。機體的正常代謝產(chǎn)物中活性氧(ROS)及氧自由基是mtDNA損害的主要原因。ROS能攻擊許多不同的細胞大分子，包括蛋白質(zhì)，脂質(zhì)和DNA。其中對衰老而言，ROS對DNA的傷害是最重要的，mtDNA在位置上非常接近線粒體ROS產(chǎn)生部位，隨著衰老的進程，有絲分裂后組織中mtDNA缺失和點突變隨之出現(xiàn)，而且在老年個體中達到高水平，尤其在負責mtDNA復制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域尤為明顯，mtDNA突變的增加，加速了衰老進程。另一方面ROS可激活線粒體透性轉(zhuǎn)變通道(mtPTP)，造成能量缺損和氧化性損傷，引起細胞凋亡〔2〕。氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA，一方面它可能引起細胞代謝及功能障礙甚至死亡，其含量與細胞損傷的程度呈正相關，可間接反映出機體受自由基攻擊的嚴重程度。另一方面它可以通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大ROS的作用?？寡趸镔|(zhì)SOD是機體清除過多ROS及氧自由基的主要物質(zhì)，能夠降低其對機體的氧化損傷。

本實驗首先從總mtDNA中進行PCR反應，檢測mtDNA4977，并設計總mtDNA中總長度為700 bp的片段作為內(nèi)參，通過mtDNA4977/內(nèi)參比例結(jié)果反應缺失突變mtDNA4977在總mtDNA中的比例，這一數(shù)據(jù)也可以較好的反應各自間的倍數(shù)關系。本文結(jié)果表明mtDNA4977缺失突變與細胞的衰老有關，同時松花粉抗衰老的作用可能與降低mtDNA4977缺失突變有著密切的關系。同時進行松花粉對細胞體內(nèi)氧化環(huán)境的影響結(jié)果看，松花粉能明顯增加細胞體內(nèi)的SOD活性，降低其中MDA的含量。因此，推測松花粉降低抑制衰老成纖維細胞mtDNA缺失突變的作用可能通過降低細胞內(nèi)的內(nèi)的氧化損傷有著密切的關系。

本研究結(jié)果初步揭示了松花粉可以降低線粒體DNA的缺失突變，其抗衰老作用可能與這一生理作用有關。這一研究結(jié)果為中醫(yī)延緩衰老開辟了新的研究途徑，對了解線粒體DNA在細胞衰老中的作用和細胞凋亡與衰老關系的研究，以及揭示細胞衰老的機制都將具有重要意義。

1 de Grey AD.Three detailed hypotheses implicating oxidative damage to mitochondria as a major driving force in homeotherm aging〔J〕.Eur J Biochem，2002;269(8):1995.

2 Trifunovic A，Wredenberg A，F(xiàn)alkenberg M，et al.Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase〔J〕.Nature，2004;429(6990):417-23.

3 鐘 馨，喻 陸.松花粉抗成纖維細胞復制性衰老的機制〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(15):1904-7.

4 趙立新，喻 陸.松花粉延緩細胞衰老及對細胞端粒酶活性的影響〔J〕.四川中醫(yī)，2004;22(4):11-3.

5 王學美，富 宏，劉庚信.增齡對大鼠心肌線粒體DNA氧化損傷的影響〔J〕.中國老年學雜志，2003;23(5):592-3.

6 韓維舉，韓東一，楊偉炎，等.大鼠不同組織器官線粒體DNA缺失定量分析及與老化的關系〔J〕.軍醫(yī)進修學院學報，2002;23(4):305-7.

7 Nekhaeva E，Bodyak ND，Kraytsberg Y，et al.Clonally expanded mtDNA point mutations are abundant in individual cells of human tissues〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002;99(8):5521-6.

8 Genova ML，Pich MM，Bernacchia A，et al.The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2004;1011(4):86-100.

9 Jou MJ，Peng TI，Reiter RJ，et al.Visualization of the antioxidative effects of melatonin at the mitochondrial level during oxidative stress-induced apoptosis of rat brain astrocytes〔J〕.J Pineal Res，2004;37(1):55-70.

10 Ross OA，Hyland P，Curran MD，et al.Mitochondrial DNA damage in lymphocytes:a role in immunosenescence〔J〕.Exp Gerontol，2002;37(23):329-40.

11 Gerhard GS，Benko FA，Allen RG，et al.Mitochondrial DNA mutation analysis in human skin fibroblasts from fetal，young，and old donors〔J〕.Mech Ageing Dev，2002;123(23):155-66.

12 Barron MJ，Johnson MA，Andrews RM.Mitochondrial abnormalities in ageing macular photoreceptors〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2001;42(12):3016-22.