郭 鵬， 沈維高， 趙麗晶， 閆喜惠， 劉艷波， 趙雪儉△

(北華大學(xué)1附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013;3吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心，吉林 長春 132001)

凋亡抑制基因survivin是1997年分選出來的一個新基因。人類survivin基因定位于染色體17q25，長約75～130 kb，含3個內(nèi)含子和4個外顯子，無TATA啟動子結(jié)構(gòu)，其編碼鏈包含1個開放閱讀框架，產(chǎn)生由142個氨基酸組成的分子量約16.6 kD的胞質(zhì)蛋白[1]。Survivin在大多數(shù)人類腫瘤中均有高表達，前列腺癌也不例外，且與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2]，其表達強度和前列腺癌細胞凋亡呈負相關(guān)[3]。RNA干擾可作為引物使mRNA轉(zhuǎn)變成dsRNA，新生的dsRNA被降解，在消除靶mRNA同時又產(chǎn)生更多的siRNA，如此循環(huán)[4]。因此siRNA具有特異性、作用效率較高和干擾作用可擴散等特點，具有很強的抑制目的基因表達的作用。本課題組前期工作表明，針對survivin靶點的siRNA重組質(zhì)粒體外明顯抑制激素非依賴性前列腺癌DU145細胞生長并促進其凋亡[5]，本實驗主要研究survivin－siRNA是否具有體內(nèi)抑瘤效應(yīng)，并簡要探討其作用機制。

材料和方法

1 材料

人激素非依賴性前列腺癌DU145細胞株，由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心饋贈;大腸桿菌JM109為該中心保存;survivin－siRNA及對照質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定按本課題組以前方法[5];DNA純化試劑盒、DNA提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基為HyClone生產(chǎn)，新生牛血清購自北京鼎國公司;兔抗人survivin抗體及羊抗兔Ⅱ抗購自 Santa Cruz，臺盼藍購自 Sigma，K－PBS溶液(NaCl 30.8 mmol/L、KCl 20.7 mmol/L、Na2HPO48.1 mmol/L、KH2PO41.46 mmol/L、MgCl210 mmol/L 溶解于雙蒸水)為自制;TUNEL染色試劑盒購自南京建成生物試劑公司;其它試劑為進口或國產(chǎn)分析純;ECM830電轉(zhuǎn)染儀購自BTX。

2 動物

裸鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。BALB/c nu/nu雄性裸鼠，15只，4～6周齡，體重18～20 g，飼養(yǎng)于恒定溫度(22～25℃)、恒定濕度(40% ～50%)的SPF層流室中，經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準飼料和水供動物自由食用。

3 方法

3.1 裸鼠動物模型的建立及處理 將DU145細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液，離心，細胞團塊在IMDM培養(yǎng)液中吹散，經(jīng)臺盼藍實驗證實細胞活力≥95%，最終細胞濃度為2.5×1010cells/L，取5×106個細胞(0.2 mL)接種于裸鼠左側(cè)背部皮下。待移植瘤長至直徑8 mm時將瘤無菌條件下取出，分成直徑約2 mm的瘤塊植入另取的15只裸鼠皮下。質(zhì)粒溶解于K－PBS溶液中，定量，調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度為1 g/L。待移植瘤長至直徑約8 mm時將裸鼠隨機分為3組，每組5只動物，mock組注射20 μL K－PBS;scrambled siRNA及survivin－siRNA進行質(zhì)粒治療(每只20 μg);在注射結(jié)束后于注射局部實行電轉(zhuǎn)染。電脈沖治療儀的參數(shù)設(shè)定:電場強度500 V/cm，脈沖時值5 μs，次數(shù)2次，頻率1 Hz。兩排銀電極插入腫瘤組織兩側(cè)，使腫瘤位于電極中央。10 d后重復(fù)注射質(zhì)粒1次。

3.2 腫瘤觀察及測量 每天觀察裸鼠各種生活變化，每隔5 d測量腫瘤的長徑(length，L)和短徑(width，W)，根據(jù)公式 V=L×W2×0.52計算腫瘤的體積，繪制腫瘤的生長曲線并計算抑瘤率(inhibitory rate，IR)，IR(%)=(1－治療組瘤重/對照組瘤重)×100%。

3.3 腫瘤標(biāo)本處理 在初次電轉(zhuǎn)染25 d后頸椎脫臼處死裸鼠，迅速剪開皮膚，完整剝離腫塊，稱重，部分組織甲醛溶液固定。

3.4 病理學(xué)檢查 取10%甲醛固定后的組織，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片分別行HE染色和survivin免疫組織化學(xué)染色。每張切片觀察3個視野，每個視野連續(xù)數(shù)300個細胞，計算陽性細胞百分比。陽性細胞百分比=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。結(jié)果判定:survivin在腫瘤細胞胞漿或細胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，且著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。

3.5 TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制的3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗2 min×3次。標(biāo)本用proteinase K 37℃消化15 min，加標(biāo)記緩沖液，每片20 μL;然后加稀釋的 TdT和DIG－dUTP混合液，37℃孵育2 h。TBS洗2 min×3次。加封閉液每片 50 μL，室溫 30 min，不洗。再加入生物素化抗地高辛抗體于標(biāo)本片上，37℃反應(yīng)30 min。TBS洗2 min×3次。加稀釋的SABC染色60 min，TBS洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

細胞核染為棕黃色者即為凋亡細胞，每張切片觀察3個視野，每個視野連續(xù)數(shù)300個細胞，計數(shù)凋亡細胞百分比即為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI(%)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 腫瘤體積監(jiān)測

裸鼠背部皮下注射DU145細胞后可成功復(fù)制出荷瘤動物模型，然后將腫瘤組織取下，分成約2 mm×2 mm×2 mm小塊接種背部，待移植瘤長至直徑約8 mm，平均體積約(161.5±14.4)mm3時，隨機分為3組，每組5只動物，并進行治療，10 d后重復(fù)給藥1次。從種植瘤塊當(dāng)天開始連續(xù)觀察腫瘤的生長情況，并繪制各組裸鼠腫瘤的生長曲線圖，見圖1。與mock組及scrambled siRNA組相比，survivin－siRNA治療組動物移植瘤生長較緩慢，初次治療后15 d，腫瘤體積明顯縮小(P＜0.05);且隨時間延長，治療組動物腫瘤生長顯著減慢(P＜0.01)。于初次電轉(zhuǎn)染25 d(即瘤塊接種后35 d)處死動物取移植瘤稱重，與兩對照組相比，治療組移植瘤重量明顯減輕(P＜0.01)，見表 1。

Figure1.Growth curves of DU145 xenografts treated with survivin－siRNA.Each treatment with the plasmid is shown using an arrow..n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs mock or scrambled siRNA.圖1 Survivin－siRNA對裸鼠腫瘤生長曲線的影響

表1 Survivin－siRNA對前列腺癌移植瘤重量的影響Table1.The effect of survivin－siRNA on xenograft weight(g..n=5)

表1 Survivin－siRNA對前列腺癌移植瘤重量的影響Table1.The effect of survivin－siRNA on xenograft weight(g..n=5)

＊＊P ＜0.01 vs mock or scrambled siRNA.

Group Weight Mock 1.64 ±0.46 Scrambled siRNA 1.67 ±0.33 Survivin-siRNA 0.62 ±0.14＊＊

2 腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色顯示，兩對照組動物腫瘤生長旺盛，細胞核較大深染，而治療組與兩對照組相比，瘤組織內(nèi)死亡細胞較多，細胞崩解為碎片，細胞核固縮碎裂，正常組織結(jié)構(gòu)消失，呈現(xiàn)無結(jié)構(gòu)嗜伊紅染色區(qū)等形態(tài)學(xué)改變，見圖2。

3 腫瘤組織survivin表達

由圖3可知，survivin表達的陽性顆粒主要位于腫瘤細胞的胞漿內(nèi)，少數(shù)位于細胞核和間質(zhì)中。Mock組陽性細胞為(67.2±11.3)%，scrambled siRNA組陽性細胞為(71.2±8.91)%，而survivin－siRNA組其表達明顯降低，陽性率為(31.2±8.3)%，與兩對照組比較差異顯著(P＜0.01)。

Figure2.HE staning for DU145 xenografts treated with survivin－siRNA(×200).Blue arrows represent death cells.圖2 前列腺癌移植瘤HE染色結(jié)果

Figure3.Immunohistochemical analysis of survivin expression inDU145 xenografts treated with survivin－siRNA( × 200) ． Blue arrows represent survivin － positivecells．圖3 前列腺癌移植瘤survivin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

4 腫瘤細胞凋亡檢測

治療組腫瘤組織內(nèi)見大量細胞核染為棕黃色的凋亡細胞，而兩對照組僅見少許凋亡細胞，見圖4。如表2所示，治療組細胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P ＜0.01)。

Figure4.Apoptosis of DU145 xenografts treated with survivinsi RNA detedcted by TUNEL assay(×200).Blue arrows represent apoptotic cells.圖4 TUNEL染色檢測前列腺癌移植瘤細胞凋亡情況

表2 Survivin－siRNA對DU145細胞移植瘤凋亡指數(shù)的影響Table2.Apoptotic index(AI)of DU145 xenografts treated with survivin－siRNA(%..n=5)

表2 Survivin－siRNA對DU145細胞移植瘤凋亡指數(shù)的影響Table2.Apoptotic index(AI)of DU145 xenografts treated with survivin－siRNA(%..n=5)

＊＊P ＜0.01 vs mock or scrambled siRNA.

Group AI Mock 4.13 ±1.71 Scrambled siRNA 5.64 ±1.32 Survivin －siRNA 27.90 ±5.91＊＊

討 論

Survivin作為新的凋亡抑制因子，其獨特的組織表達特異性及促進增殖、抑制凋亡等生物學(xué)功能受到國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。圍繞survivin的分子生物學(xué)特點、生物學(xué)功能，特別是在細胞凋亡中的作用進行了一系列研究，證實survivin是一個多功能的分子[6]。其功能主要包括:(1)在染色體過客蛋白復(fù)合物中定位和有絲分裂中起關(guān)鍵作用;(2)survivin通過caspase和非caspase途徑對腫瘤細胞凋亡進行調(diào)控;(3)survivin在腫瘤細胞中的表達情況與腫瘤的放、化療抵抗關(guān)系密切，某些藥物可通過抑制survivin的表達發(fā)揮抗癌效應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有的研究，其抗凋亡作用及在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)逐步得到肯定[7]。此外，腫瘤細胞中survivin過表達會幫助腫瘤細胞逃避細胞周期檢驗點，從而使腫瘤細胞逃避凋亡，實現(xiàn)異常增殖。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，用雄激素刺激激素依賴性前列腺癌細胞(LNCaP)能夠增加survivin的表達，相反，抗激素治療會降低其表達。通過轉(zhuǎn)染增加survivin的表達還會降低抗雄激素藥物的治療效果。進一步研究發(fā)現(xiàn)[9]，在LNCaP和激素非依賴性前列腺癌細胞(PC－3和DU145)過表達survivin會增加對紫杉醇(抗腫瘤藥)的抗性等。

本課題組應(yīng)用真核細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將特異性survivin－siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌DU145細胞株，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒可促進細胞凋亡并抑制細胞內(nèi)survivin基因及蛋白表達[10]，為體內(nèi)研究奠定了堅實基礎(chǔ)。本實驗復(fù)制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型，并在腫瘤內(nèi)注射了DNA，但裸DNA轉(zhuǎn)染效率低，抑制靶蛋白表達作用不理想。其主要原因可能有:(1)DNA必須穿過細胞膜;(2)DNA到達細胞內(nèi)后，需通過核膜進入細胞核。因而嚴重阻礙了該技術(shù)的進一步應(yīng)用。如何提高siRNA的抑制效率，尋找更有效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染手段，日益受到重視。電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法，克服了病毒載體容量小、具有安全隱患等問題。所謂電脈沖法是將組織置于高壓脈沖電場內(nèi)，在注射部位給予短時間的電脈沖，通過電刺激，使細胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔，促使腫瘤周圍DNA滲進細胞內(nèi)，易于獲得更多的DNA質(zhì)粒到細胞質(zhì)，但目前尚不清楚是否電刺激有利于質(zhì)粒穿過細胞核屏障到達細胞核內(nèi)[11]。但有研究表明，電脈沖基因轉(zhuǎn)染效率較單純注射質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染效率提高近50倍，并可持續(xù)表達，最長可持續(xù)6個月以上[12]。本實驗利用電脈沖方法將治療質(zhì)粒及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞內(nèi)，結(jié)果證實:與兩對照組相比，survivin－siRNA組在初次治療后15 d腫瘤體積與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，隨著治療時間的延長，平均瘤體積和瘤重量均明顯降低(P＜0.01)。這說明電脈沖介導(dǎo)的基因體內(nèi)治療方法可行，并具備安全、簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點，具有實際應(yīng)用前景。

通過HE染色和TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，治療組腫瘤細胞發(fā)生明顯凋亡，凋亡指數(shù)明顯升高;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，survivin－siRNA重組質(zhì)粒降低腫瘤組織內(nèi)survivin蛋白表達，說明survivin－siRNA抑制腫瘤生長是通過促進細胞凋亡實現(xiàn)的，但具體的凋亡途徑還需進一步探討。

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