葉立偉， 陳 嫻，武 睿， 段 亮，張昀源， 楊 霞，王海燕， 何通川，周 蘭

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其病因和發(fā)病機(jī)制目前并未完全闡明，目前比較明確的是幽門螺桿菌的感染與其相關(guān)，雖然抗幽門螺桿菌治療的成功使胃癌的發(fā)生已有所減低[1]，但其發(fā)病率和致死率仍位于癌癥的第4位和第2位[2]，仍然是危害人類健康的主要?dú)⑹种唬蚀?，我們?duì)胃癌的基礎(chǔ)研究仍需不斷加強(qiáng)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)超家族的成員之一，最初因其能誘導(dǎo)骨的形成而得名。近來的研究發(fā)現(xiàn)該家族多個(gè)成員和腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有密切的關(guān)系，已有關(guān)于抑制腦腫瘤、前列腺癌、結(jié)直腸癌的生長和促進(jìn)其凋亡的報(bào)道[3－5]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)BMPs對(duì)骨肉瘤也有抑制作用[6]。關(guān)于BMPs對(duì)胃癌的報(bào)道存在較大的爭議，有學(xué)者認(rèn)為BMP2高表達(dá)可以促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移，是預(yù)后不良的表現(xiàn)[7];也有報(bào)道BMP2基因甲基化失活可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)，過表達(dá)BMP2可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖[8－9]。為進(jìn)一步探討B(tài)MP對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，我們以重組腺病毒 AdBMP2和AdBMP9感染人胃癌MNK－45細(xì)胞，觀察MNK－45細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移情況。

Wnt/β－catenin信號(hào)途徑與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]，β－catenin在胞漿中的高度聚積是該途徑活化的標(biāo)志。很多研究提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt/β －catenin被異常激活[11]。GSK －3β 是多功能的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其功能的發(fā)揮主要受自身磷酸化位點(diǎn)的影響，通常認(rèn)為Tyr216的磷酸化使其活化，而 Ser9的磷酸化會(huì)使其失活[12－13]，目前發(fā)現(xiàn) GSK －3β 可以作用于40 多種蛋白底物，對(duì)細(xì)胞的生長、分化、遷移和凋亡均有影響[13]。為探討B(tài)MP2和BMP9對(duì)MNK－45細(xì)胞的作用機(jī)制是否是通過Wnt/β－catenin信號(hào)途徑，我們觀察了重組腺病毒AdBMP2和AdBMP9感染的MNK－45細(xì)胞β－catenin和GSK－3β的表達(dá)水平。

材料和方法

1 材料

胃癌細(xì)胞 MNK－45、重組腺病毒 AdBMP2、AdBMP9和AdGFP均由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室何通川教授惠贈(zèng);DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone;細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning Costar;MTT和DMSO購自Sigma;Hoechst 33258染料購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;所用的Ⅰ抗包括 BMP2、BMP9、GSK－3β、p－GSK－3β(Ser9)和β－catenin均購自Santa Cruz;兔抗羊免疫組化試劑盒PV－6002(Ⅱ抗)和DAB購自北京中杉金橋公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌細(xì)胞MNK－45用DMEM，加入 10%FBS和1%青、鏈霉素，0.25%胰蛋白酶消化后置于37℃、5%CO2飽和濕度箱中培養(yǎng)，此細(xì)胞為貼壁生長型細(xì)胞。

3 實(shí)驗(yàn)分組

(1)空白組:不施加任何處理因素的MNK－45細(xì)胞;(2)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組:AdGFP感染的MNK－45細(xì)胞;(3)實(shí)驗(yàn)組:AdBMP2和AdBMP9分別感染MNK－45細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

4 方法

4.1 免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry，ICC) 對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞制備細(xì)胞爬片(24孔板)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞株融合度達(dá)50%左右時(shí)分別加入適量相應(yīng)的腺病毒(熒光顯微鏡下觀察感染病毒的細(xì)胞占總細(xì)胞的30%左右為宜)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察和培養(yǎng)，分別于感染后48 h棄去舊培養(yǎng)基，進(jìn)行ICC，具體操作見北京中杉金橋公司免疫組化試劑盒說明書(注:胞漿中有棕黃色顆粒為陽性)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image－Pro Plus(IPP)6.0分析。

4.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 用0.25%胰蛋白酶消化MNK－45細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔1000個(gè)接種于96孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入AdGFP、AdBMP2和 AdBMP9，6～8 h后換成雙無培養(yǎng)基，此時(shí)記為0 h，于24 h始用MTT法于波長為492 nm處測(cè)吸光度(A);連續(xù)檢測(cè)5 d。

4.3 Hoechst 33258熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 Hoechst 33258熒光染色法:對(duì)數(shù)生長期骨肉瘤細(xì)胞種板(24孔板)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞株融合度達(dá)60% ～70%時(shí)分別加入相應(yīng)的腺病毒，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)觀察和培養(yǎng)，6～8 h后換成含1%FBS的培養(yǎng)基，此時(shí)開始計(jì)時(shí)，72 h后按照凋亡試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞，并計(jì)算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

FCM:取對(duì)數(shù)生長期的MNK－45細(xì)胞以2.5×105接種于T25培養(yǎng)瓶，貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)，分組及處理方式同前。72 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗2次，1 mL PBS重懸細(xì)胞。30 min內(nèi)送重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院進(jìn)行檢測(cè)。

4.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

4.4.1 劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長期MNK－45細(xì)胞種板(6孔板)，細(xì)胞融合度達(dá)70% ～80%時(shí)分別用相應(yīng)的腺病毒感染，6～8 h換液，24 h后鏡下觀察感染病毒的細(xì)胞占總細(xì)胞的30%左右，并用10 μL Tips頭(Fisher)在孔的正中輕輕做十字劃痕，于72 h取出孔板，在同一觀察點(diǎn)處動(dòng)態(tài)觀察劃痕愈合情況。比較各組細(xì)胞的愈合情況，通過測(cè)量多個(gè)點(diǎn)劃痕寬度，計(jì)算平均劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度－72 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

4.4.2 Transwell小室 將小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射過夜。用不含血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，將MNK－45細(xì)胞密度調(diào)整為3×105cells/well與400 μL雙無DMEM培養(yǎng)基混勻加入上室中;在下室即24孔板內(nèi)加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，結(jié)晶紫染液常溫染色30 min，PBS洗3次。染色完畢后將小室自然風(fēng)干，將小室膜置于載玻片上在顯微鏡下觀察、計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

4.5 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平 對(duì)數(shù)生長期MNK－45細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)60% ～70%時(shí)分別用相應(yīng)的腺病毒感染，6～8 h換液，24 h后鏡下觀察病毒感染情況在30%左右，此時(shí)開始計(jì)時(shí)。72 h后提取細(xì)胞總蛋白，分光光度法測(cè)蛋白濃度，每個(gè)上樣孔以200 μg的量上樣 ，所有Ⅰ抗的稀釋度均為1∶1000，按DAB試劑盒說明書進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，并用Gel Doc凝膠成像儀采集圖像;用Quantity One 4.5.0軟件測(cè)定各條帶的灰度值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 重組腺病毒攜帶的目的基因BMP2和BMP9在MNK－45細(xì)胞中成功表達(dá)

ICC法示AdBMP2和 AdBMP9感染48 h后，BMP2和BMP9的表達(dá)水平明顯高于空白組和AdGFP組，IPP軟件分析棕色顆粒的吸光度值示AdBMP2組是 GFP 組的 1.89倍(P ＜0.05)，而AdBMP9組是AdGFP 組的1.67倍(P ＜0.05)，表明重組腺病毒攜帶的目的基因BMP2和BMP9在被感染的MNK－45細(xì)胞中成功表達(dá)，見圖1。

Figure1.Expression of BMP2 and BMP9 in MNK －45 cells after infected with AdGFP，AdBMP2 or AdBMP9 measured using immunocytochemistry assay(×100).圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)AdBMP2或AdBMP9感染MNK－45細(xì)胞48 h后BMP2和BMP9蛋白的表達(dá)

2 上調(diào)BMP2和BMP9表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞MNK－45的增殖

MTT法顯示，AdBMP2組和AdBMP9組的MNK－45活細(xì)胞數(shù)在前3 d較對(duì)照組無明顯變化;AdBMP2組第4、5 d的活細(xì)胞數(shù)分別較GFP組降低34.39%和49.15%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);AdBMP9組第 4、5 d的活細(xì)胞數(shù)分別較AdGFP組降低36.20%和56.13%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。這說明BMP2和 BMP9抑制MNK－45細(xì)胞的增殖，并呈時(shí)間依賴性。

3 上調(diào)BMP2和BMP9表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞MNK－45的凋亡

Figure2.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on proliferation of MNK－45 cells measured using MTT assay..n=3.*P ＜0.05 vs AdGFP group.圖2 BMP2和BMP9作用后胃癌細(xì)胞MNK－45增殖的變化

AdBMP2和AdBMP9作用于MNK－45細(xì)胞72 h后，Hoechst33258染色可見這2組凋亡細(xì)胞數(shù)目較空白組和AdGFP組明顯增加，AdBMP2組細(xì)胞凋亡率較AdGFP組增加2.58倍(P＜0.01);AdBMP9組細(xì)胞凋亡率較AdGFP組增加2.69倍(P＜0.01)，空白組與AdGFP組相比無明顯差異，見圖3A、C。

流式細(xì)胞術(shù)顯示，AdBMP2組和AdBMP9組凋亡細(xì)胞數(shù)目較空白組和AdGFP組明顯增加，AdBMP2組早期凋亡細(xì)胞是AdGFP組的3.22倍(P＜0.01)，晚期凋亡細(xì)胞是 AdGFP組的2.12倍(P＜0.05);AdBMP9組早期凋亡細(xì)胞是AdGFP組的1.86倍(P＜0.05)，晚期凋亡細(xì)胞是AdGFP組的5.18倍(P＜0.01);空白組與AdGFP組相比無明顯差異，見圖3B、D。Hoechst 33258染色與流式細(xì)胞術(shù)一致，提示BMP2和BMP9均可以促進(jìn)MNK－45細(xì)胞的凋亡。

Figure3.The effects of BMP2 and BMP9 overexpression on apoptosis of MNK －45 cells.Apoptosis was measured using Hoechst 33258 staining(×100;A，C)and flow cytometry(B，D)after 72 h..n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖3 BMP2和BMP9作用后MNK－45細(xì)胞的凋亡情況

4 上調(diào)BMP2和BMP9表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞MNK－45的遷移

圖4可以看出空白對(duì)照組和AdGFP組劃痕均在72 h基本愈合，而AdBMP2組和AdBMP9組可見細(xì)胞往劃痕區(qū)生長，愈合率分別是59.91% ±2.41%和49.91%±2.19%，與對(duì)照組比差異顯著(P＜0.01)，空白組與AdGFP組之間無明顯差異(P＞0.05)。

Figure4.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on the migration of MNK－45 cells measured by wound healing assay(×100).圖5 BMP2和BMP9作用MNK－45細(xì)胞后遷移能力的改變

圖5顯示AdBMP2組和AdBMP9組較AdGFP組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，AdBMP2組為AdGFP組的36.84%，AdBMP9組為 AdGFP 組的38.12%，分別較AdGFP組降低61.88% 和 63.16%，差異顯著(P＜0.01)，而空白組與AdGFP組之間無明顯差異(P ＞0.05)。

以上2個(gè)實(shí)驗(yàn)均表明，BMP2和BMP9均可以抑制胃癌細(xì)胞MNK－45的遷移。

Figure5.Effects of BMP2 and BMP9 overexpression on the migration of MNK－45 cells measured by Transwell chambers(×150)..n=3.＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖5 BMP2和BMP9作用MNK－45細(xì)胞后遷移能力的改變

5 上調(diào)BMP2和BMP9表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞MNK－45 p－GSK－3β的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AdBMP2和AdBMP9作用于MNK－45細(xì)胞72 h后，這2組p－GSK－3β的表達(dá)量分別較AdGFP組增加9.94倍(P＜0.01)和15.97倍(P ＜0.01)，AdGFP 組和空白對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而各組間總GSK－3β的表達(dá)量相比均無明顯差異(P＞0.05)，提示BMP2和BMP9能增加MNK－45細(xì)胞p－GSK－3β的水平，但對(duì)總GSK－3β無明顯影響，見圖6。圖6還顯示，無論AdBMP2還是AdBMP9的處理都對(duì)β－catenin的表達(dá)量無明顯影響(P＞0.05)。

Figure6.GSK －3β and β －catenin protein expression in MNK－45 cells infected with AdBMP2 and AdBMP9 for 72 h detected by Western blotting..n=3.＊＊P＜0.01 vs AdGFP group.圖6 BMP2和BMP9對(duì) MNK－45細(xì)胞內(nèi) GSK－3β和β－catenin表達(dá)水平的影響

討 論

BMP2和BMP9作為TGF－β蛋白家族的成員，在本研究中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)人胃癌細(xì)胞MNK－45的增殖具有抑制作用，并且該作用呈一定的時(shí)間依賴性;同時(shí)，能夠促進(jìn)該細(xì)胞凋亡，抑制其遷移。這與我們前期研究BMPs成員對(duì)骨肉瘤的抑制和文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)結(jié)直腸癌的抑制性作用是一致的[5－6]，以上提示其在腫瘤的治療發(fā)面具有潛在的臨床價(jià)值。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)BMP2和BMP9均能使胃癌MNK－45細(xì)胞的p－GSK－3β水平升高，但對(duì)總GSK－3β和 β－catenin的表達(dá)無明顯影響，而GSK－3β和 βcatenin都是經(jīng)典Wnt/β－catenin途徑的關(guān)鍵分子，二者是否與BMPs對(duì)胃癌MNK－45的抑制作用有關(guān)呢?首先我們了解一下Wnt/β－catenin途徑:是一組胞間分泌蛋白Wnts，通過與細(xì)胞膜上Frz受體家族成員作用將信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)DVL蛋白傳至GSK－3β，使其功能受到抑制，致使β－catenin、GSK－3β和APC形成的蛋白降解復(fù)合體不能磷酸化β－catenin，繼而抑制其泛素化和降解，導(dǎo)致胞漿中游離的β－catenin增多，后者便進(jìn)入胞核與轉(zhuǎn)錄活化因子TCF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。β－catenin是該途徑的中心分子，它在胞漿中的水平升高是該途徑激活的標(biāo)志。而在本文中雖然GSK－3β發(fā)生了磷酸化失活，但是什么原因?qū)е娄拢璫atenin的表達(dá)水平無變化呢?

一般認(rèn)為 p－GSK－3β磷酸化失活有2種作用[12]，一種是使Wnt信號(hào)通路降解復(fù)合體解聚，β－catenin的磷酸化受抑制，而在胞漿中大量積聚，但是本研究中卻發(fā)現(xiàn)BMP2和BMP9雖然使p－GSK－3β增高，但對(duì) β－catenin的表達(dá)影響卻不大，其原因可能是GSK－3β對(duì)β－catenin的影響本身就很復(fù)雜，它除了通過參與降解復(fù)合體影響βcatenin，也可以通過其它途徑，比如presenilin 1蛋白，在CHO、HEK293、MEF等細(xì)胞中 GSK －3β 磷酸化失活可以使presenilin 1蛋白升高，而后者通過其它分子降低細(xì)胞中β－catenin的穩(wěn)定性從而促進(jìn)其降解[14]，所以p－GSK－3β增高并不一定引起βcatenin的降解。而且BMP作用后除了影響 p－GSK－3β外，是否還影響了降解復(fù)合體其它成員的功能(比如APC)導(dǎo)致降解復(fù)合體失活，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此單純的p－GSK－3β增高，對(duì) βcatenin的表達(dá)可能影響不大，這與文獻(xiàn)報(bào)道的在胃癌細(xì)胞中GSK－3β的激活不參與β－catenin的代謝過程是一致的[15]。因此我們推測(cè)BMP2和BMP9對(duì)胃癌細(xì)胞MNK－45的抑制作用與β－catenin水平無關(guān)。p－GSK－3β的另一種作用是參與微管穩(wěn)定性的調(diào)控[16]，但其與BMP2和BMP9對(duì)胃癌細(xì)胞MNK－45的抑制作用是否相關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

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