黃春燕，趙艷瓊，鄺曉聰

(1廣西醫(yī)科大學研究生學院，南寧 530021;2廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院;3廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室)

巨噬細胞激活是炎癥反應的重要環(huán)節(jié)，在巨噬細胞過度激活下可產生各種炎性介質如TNF-α，IL-1β，引發(fā)炎癥反應，導致組織損傷。內毒素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7廣泛用于炎癥反應的研究。近期我們觀察了烏司他丁對脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞炎癥反應的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，LPS(美國Sigma公司);Trizol提取試劑盒(美國Invitrogen公司);實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(日本Toyobo公司);ELISA試劑盒(Biosource International公司);烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)。小鼠巨噬細胞株RAW264.7(美國ATCC公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將RAW264.7細胞置于95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素+鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將培養(yǎng)細胞按1×104/孔接種于96孔板中，分為三組。細胞貼壁4 h后空白對照組予生理鹽水處理;LPS組予1.0 μg/mL的 LPS處理;烏司他丁組予LPS處理(濃度同上)并分別予100、1 000、5 000和10 000 U/mL的烏司他丁處理(各濃度均為3孔)，孵育24 h。

1.2.2 觀察項目 ①細胞活性:細胞孵育24 h后PBS洗2次，每孔加入 MTT(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄上清，每孔加入DMSO，震蕩10 min，于570 nm波長處測定烏司他丁各濃度組及對照組吸光度值(OD值)。② 促炎因子表達:細胞干預后繼續(xù)孵育 2 h，再加入1.0 μg/mL 的 LPS 刺激24 h，采用ELISA法測定TNF-α、IL-1β蛋白水平(均嚴格按照試劑說明書進行，用試劑盒提供的標準曲線計算);采用 qRT-PCR法測定 TNF-α mRNA和 IL-1β mRNA表達(TNF-α上游引物:5'-GCA CAG CCT TCCTCA CAG AG-3'，下游引物:5'-ACC CGT AGG GCG ATT ACA GT-3';IL-1β上游引物:5'-GCT GTT CCC TTG ACC CAG AC-3'，下游引物:5'-GGT GAT AAC GGT GGC CTG AC-3';β-actin(內參照):上游引物 5'-CATCCGTAAAGCCTCTATGCCAAC-3'，下游引物 5'-ATGGAGCCACCGATCCA CA-3'?？?RNA抽提按Trizol抽提試劑說明書進行，逆轉錄按ReverTraAce?qRT-PCR試劑盒說明進行，PCR反應用SYBR? Green Realtime PCR Master分析，數(shù)據(jù)分析用StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)。mRNA的相對定量采用 2－ΔΔCt法計算，ΔΔCt=(Ct靶基因 － Ct內參)處理組－(Ct靶基因－Ct內參)未處理組。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較用方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞活性 烏司他丁組及對照組細胞活性比較見表1。與對照組比較，烏司他丁100～10 000 U/mL濃度范圍內細胞活性差異均無顯著性，表明烏司他丁對小鼠巨噬細胞株RAW264.7無明顯毒性。

表1 烏司他丁各濃度組及對照組細胞活性比較(OD 值，n=3， ±s)

表1 烏司他丁各濃度組及對照組細胞活性比較(OD 值，n=3， ±s)

注:烏司他丁各濃度組與對照組比較，P均＞0.05

組別 細胞活性烏司他丁組100 U/mL 96.2 ±7.6 1 000 U/mL 95.2 ±6.6 5 000 U/mL 92.6 ±7.2 10 000 U/mL 92.4 ±5.2對照組96.8 ±3.2

2.2 促炎因子表達 各組促炎因子表達 見表2。

表2 各組促炎因子表達比較(n=3，μmol/L，±s)

表2 各組促炎因子表達比較(n=3，μmol/L，±s)

注:與對照組比較，#P ＜0.001;與 LPS組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01，●P ＜0.001

組別 TNF-α IL-1β LPS 組 486.8 ±52.6# 90.1 ±15.2#烏司他丁組100 U/mL 419.3 ±76.1 82.1 ±20.2 1 000 U/mL 232.1 ±46.9△ 46.1 ±12.3*5 000 U/mL 215.8 ±38.5△ 38.6 ± 8.1△10 000 U/mL 112.6 ±20.9● 21.8 ±10.1△對照組5.8 ± 1.6 5.6 ± 1.2

3 討論

研究證實，巨噬細胞是炎性細胞中的重要組成部分，在炎癥性疾病中起重要作用。Keitn［1］等發(fā)現(xiàn)子癇前期患者體內巨噬細胞大量增殖，并分泌各種生物活性物質如TNF-a，導致炎癥級聯(lián)反應，廣泛內皮細胞損傷，血管通透性增加，全身小血管痙攣，引發(fā)血壓升高及蛋白尿。Faas［2］通過向妊娠大鼠靜脈注射內毒素造成炎性反應被過度激活，并成功建立了妊娠期高血壓疾病動物模型，表明過度炎癥反應激活可能導致子癇前期的發(fā)生。Chen等發(fā)現(xiàn)子癇前期患者白細胞分泌TNF-α mRNA明顯增多，表明TNF-α參與了子癇前期炎癥反應的發(fā)生。有研究表明IL-1β在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中含量顯著升高［3］，IL-1β 可誘導內皮細胞黏附分子VCAM-1的表達，激活內皮細胞，參與內皮細胞損傷過程［4］。本研究對照組 TNF-α、IL-1β 及其 mRNA表達極低，LPS組表達顯著增加。表明LPS能夠誘導巨噬細胞過度激活，釋放系列炎癥介質。

烏司他丁是一種典型的Kuniz型蛋白酶抑制劑，通過抑制多種酶的活性、穩(wěn)定溶酶體膜及抑制炎癥介質的釋放而發(fā)揮作用。有報道，烏司他丁可抑制體外LPS誘導的促炎因子的過量產生［5］，與本研究結果一致。Kanayama等［6］發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能預防因感染產生炎癥因子(如IL-8)引發(fā)的宮內炎癥，延長孕周，預防早產。本研究結果顯示，烏司他丁1 000～10 000 U/mL濃度范圍內能劑量依賴性的抑制 LPS 誘導的 RAW264.7 細胞釋放 TNF-α、IL-1β及其mRNA表達，與上述研究結果一致。提示烏司他丁可從細胞因子和轉錄水平上抑制LPS誘導的巨噬細胞分泌促炎因子，且該作用與烏司他丁的濃度有關。

總之，烏司他丁對巨噬細胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-1β具有負性調節(jié)作用，此可能為其抑制過度炎癥反應發(fā)生的主要機制。鑒于巨噬細胞及其分泌的炎性介質在子癇前期發(fā)病中所起的重要作用，推測烏司他丁可從抑制炎癥反應方面為子癇前期的防治提供新的思路。

［1］Keitn JC Jr，Pijnenborg R，Luyten C，et al.Maternal serum levels of macrophage colony stimulating factor are associated with adverse pregnancy outcome［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2000，89(1):19-25.

［2］Faas MM，Schuiling GA，Baller JF，et al.A new animal model for human preeclampsia:ultra-low-dose endotoxin infusion in pregnant rats［J］.Am J Obst Gyecol，1994，171(1):158-164.

［3］朱玉蓮，康睿，趙艷玉，等.IL-1β在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中的表達研究［J］.醫(yī)學臨床研究，2006，23(6):943-944.

［4］趙宏喜，姚元慶，李東紅，等.白介素-1β在妊娠期高血壓疾病中的作用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2005，27(6):557-559.

［5］Inoue K，Takano H，Sato H，et al.Protective role of urinary trypsin inhibitor in lung expression of proinflammatory cytokines accompanied by lethal liver injury in mice［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2009，31(3):446-450.

［6］Kanayama N，Maradny E，HalimA，et al.Urinary trypsin inhibitor suppresses premature cervical ripening［J］.J Obstet Gynecol Reprod Biol，1995，60(2):181-186.