陳 壯 肖 剛

1.廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000

救必應(yīng)為冬青科冬青屬植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥樹皮，又名龍膽仔、冬青仔、碎骨木、過山風(fēng)、白皮冬青、大葉冬青等，味苦性寒，有清熱解毒、涼血止血、行氣止痛等功效，始載于《嶺南采藥錄》，為我國南方地區(qū)民間常用草藥[1]。兩廣民間多用于清熱解毒，止血抗菌[2]，常用于治療感冒發(fā)熱、扁桃體炎、咽喉腫痛、急慢性肝炎、急性腸胃炎、胃及十二指腸潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、燙火傷等[3]。其治療跌打損傷、燙火傷效果顯著，美其名為救必應(yīng)[4]。目前對其藥理作用的研究主要集中于心血管系統(tǒng)，但對于其保肝降酶作用的研究還沒見報道。本實驗主要研究救必應(yīng)的水提物（IRTW）對CCl4誘導(dǎo)小鼠急性化學(xué)性肝損傷的保護作用及其機制；觀察救必應(yīng)水提物的保肝降酶作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)并為進一步提取分離確切的藥效部位奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 受試藥品：IRTW，本單位自制；陽性對照藥：聯(lián)苯雙酯（BPD）（北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)，批號：08110103）；試劑：四氯化碳（CCl4）（分析純）（上海長江化工廠生產(chǎn)，批號：20040512）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷光甘肽（GSH-Px）測定試劑盒，均來自南京建成生物工程研究所 （批號分別為20110415、20110516、20111018、20110820、20110810）。

1.1.2 儀器 電子分析天平 （德國賽多利斯生產(chǎn)，型號：BSA124S）；DY289型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速離心機[上海醫(yī)療器械（集團）有限公司手術(shù)器械廠]；高速低溫離心機（德國Biofuge Stoucctos）；微量加樣器Gilson（法國）；液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠，型號：YKH-I）；切片機（德國美康HM355S型全自動切片機）；攝影儀：OlympusPM-10型顯微攝影儀；恩普半自動生化分析儀EMP-168G（深圳市恩普電子技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；Agilent8453紫外可見分光光度計（美國）。

1.1.3 動物 SPF級昆明種小白鼠，18～22 g，雌雄兼用，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（桂）2009-0002。 小鼠分性別飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，室溫（22±2）℃，濕度（70±5）%，喂標準顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2 方法

取60只小鼠，雌雄各半，按體重隨機平均分為6組（每組各10只），即正常對照組（空白對照組），CCl4模型組，聯(lián)苯雙酯組（BPD）（150 mg/kg），IRTW 高、中、低劑量組（相當于原料藥 200、100、50 mg/kg），均灌胃給藥，劑量為 20 mL/kg，正常對照組和CCl4模型組灌胃給純凈水，每天1次，共12 d。第12天除正常對照組注射等體積的花生油外，其余各組腹腔注射含有0.08%CCl4的花生油，劑量為0.1 mL/10 g，并禁食16 h后，自取小鼠后眼眶靜脈叢取血，取肝臟作下列相關(guān)指標檢測：①收集血液，室溫靜置1 h后，于3 000 r/min離心15 min，分離血清檢測ALT、AST水平。②取肝右葉制備10%肝勻漿，分別采用相關(guān)試劑盒測定SOD、MDA、GSH-Px。③取肝左葉經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，包埋，切片，采用HE染色方法進行肝組織病理檢查。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IRTW對CCl4小鼠急性肝損傷血清ALT、AST的影響

CCl4模型組血清ALT、AST水平顯著升高 （P<0.01），IRTW能不同程度地降低肝損傷小鼠血清ALT和AST水平（P<0.01或P<0.05）。提示IRTW對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟有一定的保護作用。見表1。

表1 IRTW對CCl4急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的影響（n=10，）

表1 IRTW對CCl4急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的影響（n=10，）

注：與正常對照組比較，▲P<0.01；與 CCl4模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；“-”為無數(shù)據(jù)

組別 劑量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L）正常對照組CCl4模型組BPD組IRTW高劑量組IRTW中劑量組IRTW低劑量組--150 200 100 50 37.24±15.63 183.57±38.34▲78.43±19.07**111.65±21.97**115.84±22.38**151.64±27.58*40.35±13.27 172.91±44.86▲80.77±18.92**112.84±23.91**117.76±19.37**148.63±31.43*

2.2 IRTW對CCl4小鼠急性肝損傷肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH-Px的影響

與正常對照組比較，CCl4模型組肝組織中MDA含量明顯升高，SOD與GSH-Px活性顯著降低（P<0.01），提示肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化。而IRTW能不同程度地抑制肝組織中MDA的升高（P<0.01或P<0.05），并使SOD和GSH-Px活性明顯升高（P<0.01或P<0.05），說明IRTW有很好的抗氧化及清除氧自由基的作用。見表2。

2.3 小鼠肝臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果

小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色，質(zhì)地濕潤，柔軟有光澤且富于彈性，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，輪廓清晰，肝細胞排列整齊，大小均勻，分界清楚，無腫脹，無明顯水腫、脂肪變性，無壞死，無炎癥細胞浸潤（圖1）；CCl4模型組小鼠肝臟體積增大，呈彌漫性氣球樣變，質(zhì)脆邊緣鈍而厚，表面黃褐色，結(jié)構(gòu)紊亂不清，肝細胞核消失，出現(xiàn)以中央靜脈為中心的局部病灶性肝細胞變性、壞死和大量炎癥細胞浸潤（圖2）；BPD組小鼠肝臟顏色較紅潤，有部分肝細胞有胞漿疏松，輕度細胞水腫，偶見氣球樣變，少量炎癥細胞浸潤（圖3）；IRTW高、中劑量組小鼠肝臟顏色較紅潤，無明顯壞死，稍有輕度水腫，大部分肝細胞結(jié)構(gòu)正常（圖4、5），IRTW低劑量組雖未完全表現(xiàn)為正常對照組的紅褐色，但較CCl4模型組有明顯改觀，肝細胞仍見腫脹，大片肝細胞輕度至中度細胞水腫，偶見氣球樣變，灶性壞死及炎癥細胞浸潤（圖6）。提示IRTW對急性化學(xué)性肝損傷有保護作用。

表2 IRTW對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH-PX 的影響（n=10，）

表2 IRTW對CCl4急性肝損傷小鼠肝組織勻漿中SOD、MDA、GSH-PX 的影響（n=10，）

注：與正常對照組比較，▲P<0.01；與 CCl4模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；“-”為無數(shù)據(jù)

組別 劑量（mg/kg）MDA（nmol/mL）SOD（U/mgprot）GSH-PX（U/mgprot）正常對照組CCl4模型組BPD組IRTW高劑量組IRTW中劑量組IRTW低劑量組--150 200 100 50 6.42±1.27 18.76±2.05▲9.55±1.86**11.17±2.29**12.36±2.85**14.26±3.14*235.32±41.27 129.86±35.49▲194.16±42.09**168.91±38.75**157.34±32.71**135.46±34.55*164.41±39.77 73.62±29.35▲107.52±37.28**86.67±32.65**88.83±29.57**81.73±33.24*

3 討論

CCl4肝損傷動物模型是研究化學(xué)性肝損傷的經(jīng)典模型[5-6]，CCl4誘導(dǎo)肝損傷主要是通過細胞色素P450將CCl4分解為CCl3自由基團，能選擇性地損傷小葉中央?yún)^(qū)的肝細胞，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，使肝細胞變性壞死，細胞內(nèi)ALT、AST、自由基滲入血液而活性增高[7]。MDA是一種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的次產(chǎn)物[8]，可進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無活性脂褐質(zhì)，沉積于組織細胞中，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細胞無法維持正常代謝而死亡。SOD是機體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶之一，CCl4的攝入使其活性減弱，引起不飽和脂肪酸氧化生成過氧化物，形成脂褐質(zhì)以及使DNA、蛋白質(zhì)和酶等改變、破壞，從而加速肝臟損傷。而GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶[9]，可通過特異性催化GSH對氫化氧化物的還原反應(yīng)，而消除細胞內(nèi)有害的過氧化代謝產(chǎn)物，以阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而對保護細胞代謝的正常進行起到重要作用。

本實驗結(jié)果顯示：IRTW三個劑量組能不同程度地降低CCl4可引起肝損傷小鼠血清中ALT、AST及肝勻漿MDA水平，能不同程度地增高肝損傷小鼠肝勻漿SOD和GSH-Px的水平，且對小鼠肝臟的病理學(xué)損傷也有明顯改善。實驗研究表明IRTW對急性化學(xué)性肝損傷具有顯著保護作用，其作用機制可能是通過提高SOD、GSH-Px等抗氧化物酶的活性，從而清除氧自由基，防止脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定細胞膜，而起到保護肝細胞的作用。

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