鄧明亮 費文濤 紀素坤 張 瑞 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.華中農業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農業(yè)大學農業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

牛病毒性腹瀉（BVD）又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的一種病理過程復雜、臨床表現(xiàn)多樣的傳染病。病牛臨床表現(xiàn)為腹瀉，急、慢性黏膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，母畜流產、產死胎和畸形胎等[1]。本病世界廣泛流行，1980年李佑民首次從流產胎兒脾臟中分離到BVDV，證實了我國也存在本病。其后在全國20多個省、市都相繼發(fā)現(xiàn)了該病的存在[2-4]。該病較少表現(xiàn)特征性臨床癥狀，且多伴有持續(xù)感染和免疫耐受等隱性感染，加之缺乏安全有效的BVD疫苗，給該病的防控帶來了很多困難，導致我國牛群BVDV感染日趨嚴重[5]。BVDV除感染肉牛、奶牛、水牛和牦牛外，還可感染羊、豬、鹿等多種家養(yǎng)和野生動物[6-7]。楊得勝等[8]對福建省9個地區(qū)2006-2008年的15個大型牛場和56個散養(yǎng)戶牛進行血清學調查，品種包括奶牛、肉牛和水牛，平均陽性率達93.1%。菅復春等[9]對河南省的6個奶牛場、5個肉牛養(yǎng)殖場的181份牛奶樣品和395份血清樣品進行BVD抗體的檢測，牛奶樣品平均陽性率為58.6%，肉牛血清樣品平均陽性率為31.39%。高雙娣等[10]利用細胞中和試驗對陜西、甘肅、寧夏、青海和四川5?。▍^(qū)）部分地區(qū)的黃牛群和牦牛群進行BVDV調查，結果黃牛群BVD陽性檢出率為46.15%，牦牛群BVD陽性檢出率為30.08%。

BVD可嚴重影響牛的繁殖和生產，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失；而我國的規(guī)模化養(yǎng)牛場主要集中在北方地區(qū)，為了解北方地區(qū)牛群中該病感染情況，我們對采自北方地區(qū)2個大型屠宰場（屠宰的肉牛主要來源于東北各地養(yǎng)殖場）和青海地區(qū)的牦牛血清進行了本病的流行病學調查，以便為今后對該病的凈化與防控工作提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒和牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒，均購自IDEXX。收集內蒙古通遼市大型屠宰場肉牛血清276份，遼寧大連市大型屠宰場肉牛血清164份。屠宰場的肉牛均來自北方各地養(yǎng)殖場。牦牛血清：采自青海省祁連縣、天駿縣、湟源縣、海晏縣和門源縣5個縣共400份。

1.2 方法

1）牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒操作方法：若于冰箱中保存，應使所有組件于18～30℃下平衡30min；將SNAPBVD檢測器放置于平整的表面上，在整個檢測過程中，均必須將SNAPBVD檢測器保持在水平位置，以確保結果精準；將150μL樣品加入干凈的樣品管內；將200μL結合物加入樣品管內；將樣品管蓋上，并上下顛倒3～5次以充分混勻。將含有結合物混合液的加蓋樣品管放入45℃的培養(yǎng)箱中，至少培養(yǎng)10min；將樣品管中的內容物注入樣品孔中；15～60s后，樣品會流過結果窗并達到啟動環(huán)；在啟動環(huán)中呈色時，穩(wěn)固按下啟動器，直到啟動器與SNAP檢測器的本體齊平為止，用力按下；10min后判讀檢測結果。

2）牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒操作方法：所有試劑在使用前一律恢復至室溫（18～25℃），輕輕搖動或旋轉，使試劑混合均勻。用移液器在酶標板每孔中加入100μL樣品稀釋液，在相應的陰性和陽性對照孔中加入25μL對照血清，平行做2孔，其他各孔均加入25μL檢測血樣；輕彈酶標板或用振蕩器振蕩，將酶標板中的溶液充分混勻；在室溫（18～25℃）孵育90min，然后將反應孔中的溶液吸出。在每個反應孔中加入約300μL洗滌液進行洗滌，洗滌5次；每次洗滌后吸出所有孔中的液體，在最后1次洗滌完成后，將酶標板在吸水紙上拍干；再在每個反應孔中加入100μL酶標抗體，室溫下（18～25℃）孵育30min；再洗滌5次，在每個反應孔中加入100μLTMB底物，室溫下避光孵育10min后，每個反應孔中加入100μL終止液終止反應；將酶標儀在空氣中調零，用450nm波長測定和記錄樣品以及對照的吸光值。

3）檢測判讀?？乖瓩z測判讀：陽性結果（PI狀態(tài)）——若樣品點中所呈現(xiàn)的藍色比背景深時，則該樣品被判為陽性。陰性結果（Non-PI（非持續(xù)感染）狀態(tài)）——若樣品點中的藍色與背景相同或比背景淺時，則該樣品被判為陰性。

抗體檢測判讀：陽性對照的平均值（PCX）與陰性對照的平均值（NCX）之間，P-N的差必須大于或等于0.150的吸光（OD）值；另外，陰性對照平均值（NCX）必須小于或等于0.250的OD值，表明檢測結果有效。計算待檢血清的（樣品OD值-陰性OD值）/（陽性OD值-陰性OD值）（S/P值），若S/P值＜0.200，則判為BVDV抗體陰性；S/P值＞0.300，則判為BVDV抗體陽性。

2 結果與分析

2.1 抗原檢測結果

對采自內蒙古通遼市、遼寧大連市的2個大型屠宰場共440份肉牛血清和青海省5個縣的400份牦牛血清進行了BVD血清學抗原檢測，結果顯示3個地區(qū)均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率達1.96%，見表1。

BVD血清學抗原檢測結果顯示不同品種感染情況也不同，肉牛、牦牛血清抗原陽性數(shù)均為3份，但陽性率分別為0.68%、0.75%，見表2。

2.2 抗體檢測結果

隨機抽取668份血清（肉牛血清392份、牦牛血清276份）進行BVD血清學抗體檢測，包括以上抗原檢測為陽性的6份血清，結果顯示共檢出陽性血清392份，平均陽性率58.68%，最高陽性率達84.48%，最低陽性率20%，見表3；并且血清學抗原陽性的6份血清抗體檢測均為陰性，表明肉牛、牦牛群均存在PI牛，PI牛檢出率分別為 0.77%、1.09%，見表 4。

不同品種的血清學抗體陽性率也不同，肉牛、牦牛血清抗體陽性數(shù)分別為248、144份，陽性率分別為63.27%、52.17%，見表5。

表1 不同地區(qū)BVD血清學抗原檢測結果

表2 不同品種BVD血清學抗原檢測結果

表3 不同地區(qū)BVD血清學抗體檢測結果

表4 PI牛檢測結果

表5 不同品種BVD血清學抗體檢測結果

3 討 論

近年來，我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速，但隨著養(yǎng)牛規(guī)模的不斷擴大，BVD也呈迅猛傳播之勢，對養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大損失，給整個畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴重影響。雪梅等[11]于2002-2006年對四川阿壩牧區(qū)的牦牛進行了調查和統(tǒng)計，阿壩、紅原和若爾蓋3個縣部分地區(qū)共發(fā)病1983頭，死亡362頭，死亡率為18.26%；通過BVD瓊脂擴散試驗和BVD血清中和試驗進行血清學檢查，陽性率分別為25.0%和42.3%。薛艱省等[12]對青海省高寒牧區(qū)牦牛進行了感染情況調查，對來自瑪沁縣的87份血清樣品進行檢測，結果在87份血清樣品中檢出陽性10份，占11.49%；流行病學調查久治縣存欄牛7715頭，發(fā)病1750頭，死亡225頭，發(fā)病率和死亡率分別為22.68%和2.92%。邱昌慶等[13]對山東、河南和河北省的6個規(guī)模化肉牛場進行抗體、抗原檢測，證實我國中原地區(qū)肉牛群中BVD感染嚴重。

本次對內蒙古、遼寧肉牛和青海牦牛群進行血清學調查，結果顯示3個地區(qū)均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率為1.96%。血清學抗體平均陽性率為58.68%，最高陽性率達84.48%，最低陽性率20.00%。表明BVD在我國北方牛群中普遍存在，而且感染率和感染范圍日趨嚴重。分析其主要原因可能是集約化規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展提高了牛只間傳染的概率；近年來北方地區(qū)極端天氣的多發(fā)引起機體抵抗力下降；該病特征性臨床癥狀較少，在實際生產中易被忽視；牛群缺乏系統(tǒng)的監(jiān)測防控措施等。

調查發(fā)現(xiàn)，檢出的6份抗原陽性血清其對應血清抗體檢測均為陰性，表明牛群中存在PI牛，肉牛、牦牛PI牛檢出率分別為0.77%、1.09%，與國外報道的PI牛檢出率（0.5%～2.0%）基本相符[14]。而肉牛、牦牛群抗體陽性率分別為63.27%、52.17%，這說明血清抗體陽性率與PI牛檢出率二者之間沒有線性關系，與張俊杰等[15]調查的結果一致。雖然PI牛的存活時間一般不超2a，但終生帶毒并通過鼻液、唾液、尿液、眼淚和乳汁等分泌物向體外排毒，成為該病的危險傳染源，在規(guī)模化養(yǎng)殖場中隨著牛只的頻繁轉群變動1頭PI牛就可以在其1a左右的生存期內使整個牛群感染BVDV。因此必須制定有效的BVD清除計劃，加強PI牛的檢測，全群篩查并淘汰PI牛，逐步達到凈化牛群的目的。

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