廖章萍，劉 丹，王淑霞，李文娟，陳和平，何 明

(1.南昌大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)與分子治療學(xué)教研室，江西南昌 330006;2.江西省人民醫(yī)院，江西南昌 330046)

各種原因造成的心肌組織血液灌注量減少可使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液再灌注后，缺血性損傷不但沒(méi)有緩解，反而進(jìn)一步加重，這種現(xiàn)象稱(chēng)為心肌缺血/再灌注損傷。1986年 Murry等［1］發(fā)現(xiàn)，如預(yù)先反復(fù)短暫的缺血/再灌注則可延緩或減輕隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺血所致的心肌損傷，并把此現(xiàn)象稱(chēng)之心肌缺血預(yù)適應(yīng)。

心肌缺血/再灌注損傷會(huì)引起心肌細(xì)胞內(nèi)pH值的變化，pH可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞事件，包括離子通道傳導(dǎo)、鈣離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等，在心肌中，鈣離子穩(wěn)態(tài)及鈣對(duì)肌絲的敏感性都受pH變化影響，pH也調(diào)節(jié)縫隙連接及心肌細(xì)胞電生理偶聯(lián)。陰離子交換蛋白(anion exchanger，AEs)在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡，維持細(xì)胞內(nèi)pH值的穩(wěn)定起著非常重要的作用。AEs是一種多功能嵌膜蛋白，具有Cl－/HCO3－交換功能，泵出 HCO3－，同時(shí)泵入 Cl－，使細(xì)胞內(nèi)酸化［2］。

激活此離子交換系統(tǒng)，一方面，使細(xì)胞內(nèi)Cl－濃度增加，另一方面，可使細(xì)胞內(nèi)pH發(fā)生改變［3］。AEs包括AE1、AE2、AE3和AE4四個(gè)亞型，其中AE3在心肌中表達(dá)豐度最高。目前，關(guān)于AEs蛋白在心肌急性損傷病理生理過(guò)程的變化及其功能的研究很少，而有關(guān)AEs是否是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用更是缺乏深入探討。NO通路是近年來(lái)心肌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究熱點(diǎn)，大量研究都已證實(shí)NO［4－6］參與了心肌細(xì)胞缺血缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用。故本實(shí)驗(yàn)采用Spraguer-Dawley(SD)乳鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧(A/R)和缺氧預(yù)適應(yīng)(APC)模型，觀察AE3蛋白在心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)保護(hù)中的意義及與NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD新生大鼠(1～3 d)，♀♂不拘，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。

1.2 藥品與主要試劑 MEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，LNAME(L-N-Nitro-Arginine Methyl Ester):Sigma公司;MTT:Ameresco公司;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸酶(CPK)試劑盒:Beckman公司;引物合成:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;AE3抗體、β-actin抗體及相應(yīng)二抗均購(gòu)自Santa Cruz;總蛋白提取試劑盒:普利來(lái)公司。其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參照陳杰等［7］方法。取出生1～3 d的SD大鼠，消毒后開(kāi)胸取出心臟，分離心室組織，用0.1%胰酶消化分離心肌細(xì)胞，再加入含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基混懸后置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)培養(yǎng)2 h，利用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，將懸浮的心肌細(xì)胞用200目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，接種于相應(yīng)的培養(yǎng)板內(nèi)，于5%CO2，飽和濕度及37℃條件下培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。

1.4 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R)模型建立 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合狀態(tài)時(shí)，對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞換用預(yù)先經(jīng)95%N2和5%CO2混和氣體飽和過(guò)的模擬缺氧缺糖溶液(mmol·L－1，NaH2PO40.9，NaHCO36.0，CaCl21.8，MgSO41.2，HEPES 20，NaCl 98.5，KCl 10.0，pH 6.8，37℃)，置于持續(xù)95%N2－5%CO2平衡的A/R裝置(37℃)中缺氧孵育3 h后，再換用模擬再灌注溶液(mmol·L－1，NaCl 129.5，KCl 5.0，NaH2PO40.9，NaHCO320，CaCl21.8，MgSO41.2，glucose 55，HEPES 20，pH 7.4)，37℃于95%O2－5%CO2復(fù)氧孵育2 h。

1.5 心肌細(xì)胞缺氧預(yù)適應(yīng)(anoxia preconditioning，APC)模型建立 心肌細(xì)胞換預(yù)先經(jīng)95%N2和5%CO2混和氣體飽和過(guò)的模擬缺氧液，將細(xì)胞置于95%N2－5%CO2持續(xù)通氣的缺氧密閉容器中(37℃)30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育30 min(37℃)，重復(fù)3次。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 心肌細(xì)胞培養(yǎng)4 d后隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分4組，每組重復(fù)8次。① Control組:棄培養(yǎng)液，換用正常 Tyrode溶液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育3 h后，再換上模擬再灌注溶液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育2 h;②A/R組:棄培養(yǎng)液，換用模擬缺氧缺糖溶液將培養(yǎng)板置于持續(xù)95%N2、5%CO2平衡的缺氧密閉容器中(37℃)3 h，再換上模擬再灌注液，以95%O2、5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育 2 h(37℃);③ APC組:棄培養(yǎng)液，換用模擬缺氧缺糖液置于培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣，37℃)孵育30 min，再換模擬再灌注液，以95%O2和5%CO2混合氣體進(jìn)行復(fù)氧孵育30 min(37℃)，重復(fù)3次;然后進(jìn)行A/R處理;④ L-NAME組:在APC處理前用終濃度為50 μmol·L－1NO合成酶抑制劑L-NAME與細(xì)胞孵育30 min后，余同APC組。

1.7 心肌細(xì)胞AE3 mRNA的檢測(cè) 用TRIzol裂解心肌細(xì)胞提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入AE3和β-actin特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。AE3上、下游引物分別為:5'-AGGTCATGGAGCCCAATGG-3'，5'-GAACTTGATCCAGCGTG-3'。β-actin上下游引物分別為:5'-AAGGATTCCTATGTGGGC-3'，5'-CATCTCTTGCTCGAAGTC-3'。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)Image Tool圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的AE3的mRNA表達(dá)量。

1.8 心肌細(xì)胞AE3蛋白的檢測(cè) 按蛋白提取試劑盒的方法提取心肌細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，－20℃保存。取上述細(xì)胞蛋白提取液上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，15%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉、洗脫后加入AE3抗體(1∶500)或βactin抗體(1∶200)，放置4℃過(guò)夜，洗膜后以相應(yīng)的二抗孵育1 h，再洗膜，加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，置暗室中曝光、顯影、定影膠片。將X線膠片掃描后，在Image Tool醫(yī)學(xué)圖形分析軟件上進(jìn)行分析。將所得AE3蛋白帶的綜合密度分別除以β-actin相對(duì)應(yīng)樣本的綜合密度。

1.9 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采取MTT比色法檢測(cè)。培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板的H9c2心肌細(xì)胞，接種密度為104cells·well－1。實(shí)驗(yàn)處理后每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μl，孵育 4 h;每孔加入 150 μl DMSO振蕩10 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。設(shè)不加細(xì)胞，只加孵育液的空白對(duì)照，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率/%=(實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值)×100%。

1.10 生化檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組分別取孵育液200 μl，美國(guó)Beckman生化自動(dòng)分析儀測(cè)定LDH和CPK活性。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組對(duì)AE3 mRNA表達(dá)的影響 以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的心肌細(xì)胞AE3的 mRNA表達(dá)量，Control組、A/R組、APC組、L-NAME 組分別為 0.27±0.08、0.40±0.06、1.44±0.10、0.45±0.08。A/R 組 AE3 mRNA 轉(zhuǎn)錄較Control組增加(P＜0.05)。APC組心肌細(xì)胞AE3 mRNA不僅均較Control組轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，而且較A/R組也明顯上調(diào)(P＜0.01)。但預(yù)先加入NO合成酶抑制劑L-NAME則抑制了APC處理時(shí)AE3 mRNA轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)(P＜0.01)(Fig 1)。

2.2 不同處理組對(duì)AE3蛋白表達(dá)的影響 以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的心肌細(xì)胞AE3的蛋白表達(dá)量，Control組、A/R組、APC組、LNAME組分別為 0.23±0.06、0.36±0.08、1.16±0.10、0.39±0.06。A/R組AE3蛋白表達(dá)較Control組增加。APC組心肌細(xì)胞AE3蛋白與A/R組比較也明顯上調(diào)(P＜0.01)。而L-NAME則抑制了APC組AE3蛋白的上調(diào)(P＜0.01)。這一結(jié)果與上述心肌細(xì)胞AE3 mRNA的變化基本吻合(Fig 2)。

Fig 1 Effect of various treatments on expression of AE3 mRNA of cultured cardiomyocytes

Fig 2 Effect of various treatments on expression of AE3 protein of cultured cardiomyocytes

2.3 不同處理組對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后LDH、CPK活性的影響 如Fig 3所示，與Control組比，A/R組細(xì)胞懸液中LDH及CPK活性分別增加至4.5、4倍(P＜0.01)。經(jīng)APC處理則能降低 LDH及CPK活性(P＜0.01);但加入L-NAME則可取消APC的保護(hù)作用，LDH及CPK活性與A/R組無(wú)差異。

2.4 不同處理組對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率的影響 MTT結(jié)果(Fig 4)顯示，經(jīng)A/R處理后，H9c2心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率較Control組降低47%;APC則能防止細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率上升至88%，較A/R組增高;而L-NAME可取消APC的心肌保護(hù)作用。

Fig 3 Effect of various treatments on LDH and CPK activity in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

Fig 4 Effect of various treatments on cell viability in cultured cardiomyocytes subjected to A/R injury

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷、缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用與心肌細(xì)胞內(nèi)的Na+、K+、Ca2+等陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)的變化密切相關(guān)，然而，對(duì)于陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)的有關(guān)研究卻很少。心肌細(xì)胞內(nèi)的陰離子包括 Cl－、SO4

2－、HPO4

2－、有機(jī)酸根離子等，其中 Cl－為主要通透性的陰離子，參與了細(xì)胞多種活動(dòng)和功能調(diào)節(jié)過(guò)程，如細(xì)胞電活動(dòng)調(diào)節(jié)、容積調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)等，且在細(xì)胞免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和分化及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮一定的作用［8］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Cl－在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮重要作用，使用氯離子通道阻斷劑SITS可對(duì)抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，有明顯的保護(hù)作用［7］。心肌缺血/再灌注時(shí)Cl－濃度的變化與細(xì)胞內(nèi)pH值變化密切相關(guān)。AEs蛋白既是心肌細(xì)胞pH調(diào)節(jié)的主要方式之一，也是細(xì)胞內(nèi)的Cl－濃度調(diào)節(jié)的重要通道蛋白之一。AEs具有雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－/HCO－的功能，正常情況下其將細(xì)胞內(nèi)HCO－33排出，同時(shí)將胞外Cl－移入胞內(nèi)，使細(xì)胞酸化［9］;反之，也可反向轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－和HCO3－［10］。心臟 AEs的膜性分布允許心肌細(xì)胞精確調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH，防止代謝性CO2水化產(chǎn)生的HCO3－局部聚集，這對(duì)于心肌細(xì)胞維持正常的興奮－收縮偶聯(lián)及心臟舒縮功能具有非常重要的意義。新近研究亦證明，在肥厚性心肌病模型上，AE3蛋白的缺失可迅速導(dǎo)致失代償及心力衰竭［11］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)缺氧預(yù)處理后，AE3 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，提示AE3可能參與了預(yù)適應(yīng)保護(hù)，是一種內(nèi)源性保護(hù)蛋白。我們認(rèn)為，當(dāng)心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)短暫的缺氧處理后，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)ATP不足、ADP積聚、pH值降低，可能通過(guò)某種途徑激活A(yù)E3蛋白，AE3蛋白發(fā)揮其雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能，反向轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－和HCO3－，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)的酸中毒，使心肌細(xì)胞的酸堿緩沖容量擴(kuò)大，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值在相對(duì)恒定的范圍，以維持心肌收縮力。

本實(shí)驗(yàn)中，在心肌缺氧預(yù)處理前給予NO合成酶抑制劑L-NAME可抑制AE3 mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)，并且取消了缺氧預(yù)處理的保護(hù)作用，說(shuō)明預(yù)適應(yīng)引起的AE3表達(dá)增加與NO通路有關(guān)。大量研究表明，NO在缺血預(yù)適應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。短暫多次的缺血/再灌注可通過(guò)提高NO合成酶活性，從而促使NO合成增加，激活PKC，導(dǎo)致內(nèi)源性保護(hù)基因轉(zhuǎn)錄的增加以及蛋白表達(dá)的上調(diào)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)微血管舒張、減輕氧化應(yīng)激，減少心律失常發(fā)生的心肌保護(hù)作用［6］。給予NO受體激動(dòng)藥同樣也能產(chǎn)生類(lèi)似缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用［12］，而抑制NO的合成釋放則可取消預(yù)適應(yīng)保護(hù)［13］。

因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)AE3可能就是預(yù)適應(yīng)保護(hù)物質(zhì)的一種。缺氧預(yù)處理通過(guò)激活NO通路，使得AE3表達(dá)增加，AE3蛋白發(fā)揮其雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能，反向轉(zhuǎn)運(yùn)Cl－和HCO3－，減輕心肌細(xì)胞的酸中毒，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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