鄒小琴，毛桂福，鐘小斌，黃振光

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021; 2.廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001)

丙戊酸鈉是臨床常用的抗癲癇藥，在癲癇患兒的治療過程中，通過監(jiān)測血藥濃度實現(xiàn)個體化給藥可以提高癲癇的控制率[1－2]和減少不良反應(yīng)。衍生化－高效液相色譜(HPLC)法[3－7]是目前國內(nèi)外常用的丙戊酸血藥濃度測定方法，多采用三乙胺為催化劑。本研究以氫氧化鈉乙腈溶液為催化劑，建立了衍生化－HPLC法測定丙戊酸血藥濃度，具有干擾少、簡便快速、靈敏準確等優(yōu)點，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－20AT型四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)(LC－20AT泵，Rheodyne7725i型進樣閥，SPD－20A紫外檢測器，CTO－20A柱溫箱，DGU－20A在線脫氣機，日本島津);Hangping FA1004型電子分析天平(上海天平儀器廠);XW－80型漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)實驗儀器廠);80－2S型臺式低速離心機(上海醫(yī)療器械〈集團〉有限公司手術(shù)器械廠);L－128型氮吹儀(北京來亨科學(xué)儀器公司)。丙戊酸鈉對照品(湖南湘中制藥有限公司，含量為99.5%，批號為090405);環(huán)己羧酸(梯希愛＜上海＞化成工業(yè)發(fā)展有限公司，含量＞95.0%);α－溴苯乙酮(A Johnson Mathey Company，含量98%);甲醇、乙腈為色譜純試劑，四氫呋喃、無水乙醇和乙醚等均為國產(chǎn)分析純試劑，試驗用水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim －pack CLC －C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm)，Shim －pack CLC －C18保護柱(10 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －乙醇 － 四氫呋喃 － 水(57∶10∶8∶25);流速:1.1 mL/min;柱溫:35 ℃;檢測波長:248 nm;靈敏度:1.00 AUFS;進樣量:20 μL。

2.2 溶液配制

丙戊酸對照品溶液:精密稱取58.4 mg丙戊酸鈉對照品，置25 mL容量瓶中，用0.2 moL/L氨水溶解并定容，得到2.01 g/L的丙戊酸貯備液，置冰箱4℃保存，臨用時用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。

內(nèi)標溶液:精密稱取環(huán)己烷羧酸26.3 mg，置25 mL量瓶中，用0.2 moL/L的氨水稀釋至刻度，再取該液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得0.1g/L的內(nèi)標溶液。

衍生化試液:稱取α－溴苯乙酮63.8mg，置25mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，即得2.5 g/L的衍生化試液，密封、冷藏保存。

堿化液:氫氧化鈉 20.8 g，加水溶解，定容至500 mL，再量取該氫氧化鈉溶液1.0 mL，加水5.0mL，加乙腈定容至 25.0 mL。

2.3 血樣處理

精密吸取血清 50 μL，加入內(nèi)標溶液 50 μL，再加 3 moL/L硫酸 50 μL，混勻;加入乙醚 2 mL渦旋提取 1 min，離心 5 min(3500 r/min)，吸取上清液至離心管中，加入堿化液70 μL和2.5g/L α－溴苯乙酮溶液 100μL，漩渦混勻，在55℃水浴反應(yīng)60 min，氮氣吹干，殘渣用 200 μL甲醇溶解，旋渦振蕩30 s。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗:在本試驗條件下，以5人份的混合空白血清、空白血清加對照品與內(nèi)標、癲癇患兒服藥后的血清加內(nèi)標，按2.3項下方法處理后測定，得色譜圖1?？梢姡焖嵫苌锱c內(nèi)標衍生物分離良好，血清中無明顯內(nèi)源性雜質(zhì)干擾峰，表明本方法有較強的專屬性。丙戊酸及內(nèi)標的衍生物保留時間分別為4.38 min和6.55 min。

標準曲線繪制:將丙戊酸鈉貯備液用空白血清稀釋成質(zhì)量濃度分別為 10.0，20.1，40.1，60.2，100.4，150.5，200.7 μg/mL，按2.3項下方法處理，進樣20 μL。以丙戊酸與內(nèi)標衍生物峰面積之比(X)對丙戊質(zhì)量酸濃度(Y)進行線性回歸(加權(quán)系數(shù)1/C2)，得回歸方程 Y=94.685 X －0.245，r=0.9998。結(jié)果表明，丙戊酸質(zhì)量濃度在10～200 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。最低定量質(zhì)量濃度為 2 μg/mL(n=6，RSD≤6.6%)。

回收率試驗:取空白血清0.05 mL，制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項下方法處理后測定6次，計算方法回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 丙戊酸的回收率試驗結(jié)果(，n=6)

表1 丙戊酸的回收率試驗結(jié)果(，n=6)

加入量(μg/mL)10.060.2150.5測得量(μg/mL)10.00 ±0.1559.69 ±3.07155.54 ±2.66回收率(%)99.80 ± 1.5499.15 ± 5.10103.35 ± 1.77

精密度試驗:取空白血清0.05 mL，制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項處理后測定，1 d內(nèi)測定6次，以及1周內(nèi)測定6次，計算方法的精密度。結(jié)果見表2。

衍生物穩(wěn)定性試驗:制備低、中、高3個質(zhì)量濃度的丙戊酸血清樣品，按2.3項下方法處理后室溫放置。以0時測定值為100%，分別在5，10 h時進樣測定。結(jié)果含量分別為(100.32±1.41)%和(100.70±2.51)%，表明丙戊酸衍生物在室溫放置10 h穩(wěn)定。

表2 丙戊酸的精密度試驗結(jié)果(，n=6)

表2 丙戊酸的精密度試驗結(jié)果(，n=6)

加入量(μg/mL)日內(nèi)精密度 日間精密度10.060.2150.5測得量(μg/mL)10.00 ± 0.1559.69 ± 3.07155.54 ± 2.66 RSD(%)1.545.141.71測得量(μg/mL)9.75 ± 1.5559.59 ± 2.96152.25 ± 4.34 RSD(%)1.594.972.85

2.5 臨床應(yīng)用

32名服用丙戊酸鈉的癲癇患兒，年齡8個月～17歲，服藥劑量15～50 mg/(kg·d)，用本方法測定穩(wěn)態(tài)谷濃度，結(jié)果在治療窗(50～100 μg/mL)之內(nèi)16例，高于治療窗2例，其余低于治療窗濃度。結(jié)果表明，患兒在服用丙戊酸治療期間應(yīng)經(jīng)常監(jiān)測血藥濃度，才能達到個體化合理治療的目的。

3 討論

文獻報道的HPLC法[3－6]多采用α－溴苯乙酮作衍生劑，用量100～200μg。本試驗表明，衍生劑用量為200μg、三乙胺為20μL時，對高質(zhì)量濃度的丙戊酸血樣(200 μg/mL，血清用量為0.1 mL)，衍生程度只有82%左右，衍生化不完全，易導(dǎo)致測定誤差。當(dāng)α－溴苯乙酮用量增加至反應(yīng)物總量(包括丙戊酸和三乙胺)的6倍(摩爾倍數(shù))時，衍生反應(yīng)才較完全，產(chǎn)率達96%以上。但是，當(dāng)α－溴苯乙酮用量增加至400 μg時，柱壓增加較快，易發(fā)生堵柱現(xiàn)象。

用三乙胺乙腈溶液作催化劑，α－溴苯乙酮用量在200μg以上時，反應(yīng)產(chǎn)物雜質(zhì)較多，基線到7.5 min后才能平穩(wěn)，常常對環(huán)己羧酸內(nèi)標峰有干擾。用氫氧化鈉乙腈溶液作催化劑，雜質(zhì)少，基線3.5 min后就很平穩(wěn)，克服了用三乙胺作催化劑的缺陷。

在甲醇、水組成的流動相中加入一定量的四氫呋喃和乙醇，可加快衍生物的洗脫，縮短分析周期。本研究中建立的高效液相色譜法具有線性范圍寬、簡便快速、靈敏準確等優(yōu)點，適用于丙戊酸的常規(guī)血藥濃度監(jiān)測和藥物動力學(xué)研究。

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