楊亞軍， 李慶耀， 梁生林， 孫朝越， 劉 兵， 張 杰， 王 磊， 崔 燎

(1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西吉安343000;2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515;3.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江西吉安343000;4.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東湛江523808)

車前草為車前科(Plantaginaceae)植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥全草，是《中國(guó)藥典》(2010年版)收載的常用中藥。車前草性寒，味甘，具有清熱解毒、利尿、祛痰、涼血之功效，用于水腫尿少、暑濕瀉痢、痰熱咳嗽、癰腫瘡毒等癥［1］。據(jù)報(bào)道，車前草全草或其復(fù)方，在臨床上可用于治療慢性肝炎［2-3］，車前草粗提物對(duì)CC14致急性肝損傷有保護(hù)作用［4-5］。研究表明，車前草中含有熊果酸、齊墩果酸等三萜類化合物［6］，二者均為抗肝炎活性物質(zhì)［7］，且后者已制成抗肝炎藥在臨床上廣泛應(yīng)用。因此，本研究以自制車前草總?cè)?TTP)為實(shí)驗(yàn)材料，采用CC14誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，觀察TTP對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 江西產(chǎn)車前草，購(gòu)自亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠，批號(hào)20090901，經(jīng)井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)教研室彭才圣教授鑒定為平車前Plantago depressa Willd.;TTP浸膏，自制，經(jīng)測(cè)定其總?cè)坪辛靠蛇_(dá)53%;水飛薊賓膠囊，購(gòu)自天津天士力制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)100604;CCl4，分析純，南京化學(xué)試劑廠生產(chǎn);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號(hào)2010102)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號(hào)2010104)、總超氧化物歧化酶(T-SOD，批號(hào)2010101)、丙二醛(MDA，批號(hào)2010104)與總蛋白(T-Protein，批號(hào)2010103)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為20～24 g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(贛)2005-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)JZDWNO.2010-0287。

1.3 儀器 FA1604N電子天平;spectrumlab 53紫外-可見分光光度計(jì);電熱恒溫水浴鍋;低溫高速離心機(jī);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和造模方法 小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、陽性藥水飛薊賓組、TTP高劑量組和TTP低劑量組，每組10只。各組試藥均用0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液，自造模前7 d起，每天按0.1 mL/10 g體積灌胃給藥1次，共7次，正常對(duì)照組給予等體積溶劑。末次給藥2 h后，小鼠腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.2 mL/kg，正常對(duì)照組腹腔注射等體積花生油，在造模期間禁食，可自由飲水。實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠均食用標(biāo)準(zhǔn)條狀飼料，并觀察記錄其精神狀態(tài)、反應(yīng)活動(dòng)、毛發(fā)光澤、食欲排泄、體質(zhì)量變化等情況。造模18 h，小鼠稱質(zhì)量后，于眼眶后靜脈叢采血，室溫放置30 min后，3500 r/min離心15 min，取上清液備用;小鼠處死后，取其肝臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗，拭干，稱質(zhì)量，取肝臟右葉同一部位經(jīng)10%甲醛固定，用于病理學(xué)切片觀察;稱取定量組織，用冷生理鹽水制成10%的肝勻漿，于4℃3000 r/min離心15 min，取上清液備用。

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定方法 血清中AST和ALT的含有量，肝組織中T-Protein、T-SOD、MDA的量，均按照試劑盒說明書規(guī)范操作。

2.3 組織切片觀察 組織10%甲醛溶液固定24 h后，石蠟包埋后制成5 μm切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。將肝組織損傷程度分為4級(jí)［8］:0級(jí)(-)，肝組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性，壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);l級(jí)(+)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，可見明顯的混濁腫脹，散在的脂肪變性和細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，偶見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);2級(jí)(++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見局部區(qū)域性脂肪變性和細(xì)胞灶狀壞死，伴有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);3級(jí)(+++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清、可見彌漫性變性、壞死，伴有明顯區(qū)域性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 各組小鼠在造模前生長(zhǎng)狀態(tài)良好，進(jìn)食飲水正常，毛色光滑潤(rùn)澤，糞便呈褐色顆粒狀;造模后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均不同程度表現(xiàn)為少動(dòng)聚集，反應(yīng)遲緩，容易激怒，難以捉拿，毛發(fā)蓬亂，毛色暗淡，大便稀軟，但各組均沒有出現(xiàn)死亡情況。

各組小鼠灌胃后未見明顯中毒癥狀，實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。小鼠腹腔注射CCl4后，肝臟系數(shù)值比正常對(duì)照組增大，但模型組與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。除陽性藥外，TTP高、低劑量組小鼠肝臟系數(shù)均較模型組小鼠顯著降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。肝臟系數(shù)為小鼠肝臟濕質(zhì)量占處死前體質(zhì)量的百分比。

3.2 TTP對(duì)致肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響 與正常對(duì)照組相比，造模后各組小鼠血清ALT和AST的活性均顯著性升高(P＜0.01)，說明急性肝損傷模型復(fù)制成功;與模型組相比，TTP能降低模型小鼠ALT與AST水平，且低劑量TTP對(duì)AST的影響具有顯著性差異(P＜0.01)，見表2。

3.3 TTP對(duì)致肝損傷小鼠血清T-SOD和MDA的影響 造模后，小鼠肝組織中蛋白量普遍增高，但是給藥小鼠蛋白量均下降，且與模型組小鼠蛋白量有顯著性差異。同時(shí)，模型組小鼠肝組織中T-SOD水平下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA量升高，TTP和水飛薊賓均能增強(qiáng)T-SOD活性，降低MDA量(P ＜0.01)，見表3。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體質(zhì)量變化與肝臟系數(shù)(± s，n=10)

表1 實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠體質(zhì)量變化與肝臟系數(shù)(± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05。

/%正常對(duì)照組組別 劑量/(g·kg-1)初始體質(zhì)量/g終末體質(zhì)量/g肝臟系數(shù)- 23.7 ±0.8 27.3 ±2.0 4.84 ±0.26模型組 - 23.0 ±1.4 26.5 ±1.7 5.21 ±0.12＊＊陽性藥組 0.15 22.7 ±1.2 25.6 ±1.9 5.34 ±0.45*TTP 高劑量組 0.04 21.8 ±2.1 25.3 ±1.8 4.95 ±0.29#TTP 低劑量組 0.02 22.4 ±2.0 26.8 ±2.3 4.99 ±0.20#

表2 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響(± s，n=10)

表2 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響(± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg-1)ALT/(IU·L-1) AST/(IU·L-1)正常對(duì)照組- 21.50 ±8.91 49.15 ±6.41模型組 - 154.75 ±12.74＊＊ 198.26 ±27.10＊＊陽性藥組 0.15 107.76 ±19.51＊＊#174.82 ±25.18＊＊#TTP 高劑量組 0.04 128.55 ±10.45＊＊ 168.05 ±32.49＊＊#TTP 低劑量組 0.02 110.20 ±16.56＊＊#156.35 ±28.70＊＊#

表3 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠組織中T-SOD和MDA的影響(± s，n=10)

表3 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠組織中T-SOD和MDA的影響(± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量(g·kg-1) T-Protein/(g·L-1) T-SOD/(U·mgpro-1) MDA/(nmol·mgpro-1)正常對(duì)照組0.98 ±0.31 166.03 ±33.22 4.89 ±1.72模型組 - 1.11±0.06 96.62±17.72＊＊ 6.69±1.80*陽性藥組 0.15 1.03 ±0.05# 131.78 ±20.37*# 4.20 ±1.83#TTP 高劑量組 0.04 1.00 ±0.10# 142.98 ±26.81# 4.04 ±1.59#TTP 低劑量組 0.02 1.10 ±0.06# 153.26 ±42.37# 4.30 ±1.56-#

3.4 TTP對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)的影響

3.4.1 肉眼觀察 正常對(duì)照組小鼠肝臟組織呈鮮紅色，外表光滑亮澤，質(zhì)地柔軟，富有彈性;模型組小鼠肝臟組織呈暗紅色，表面粗糙，附著肉眼可見的黃色顆粒，缺乏彈性，體積腫大，而給藥各組小鼠肝臟病變較模型為輕。

3.4.2 光鏡觀察 正常對(duì)照組小鼠基本無異常;模型組小鼠肝小葉中央?yún)^(qū)明顯灶狀壞死，細(xì)胞不圓整，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核較小，出現(xiàn)水腫和氣球樣變，有大量脂肪變性，細(xì)胞間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);給藥組和陽性藥組中肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，肝細(xì)胞變性、壞死等病理性損傷均有不同程度的緩解，其中，TTP低劑量組最為明顯，見表4。

表4 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝組織病理損傷的影響(± s，n=10)

表4 TTP對(duì)CCl4致肝損傷小鼠肝組織病理損傷的影響(± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組別 劑量/(g·kg-1)肝細(xì)胞變性P 肝細(xì)胞壞死P 炎性浸潤(rùn)P- + ++ +++- + ++ +++- + ++ +++- 10 0 0 0 10 0 0 0 9 1 0 0模型組 - 0 2 6 2 ＊＊ 0 2 5 3 ＊＊ 0 0 4 6 ＊＊陽性藥組 0.15 3 5 1 1 ＊＊# 3 4 2 1 ＊＊# 3 5 2 0 ＊＊#TTP高劑量組 0.04 2 4 3 1 ＊＊ 2 6 1 1 ＊＊ 3 6 1 1 ＊＊#TTP低劑量組 0.02 3 4 3 0 ＊＊# 4 4 2 0 ＊＊# 2 8 0 0 ＊＊#正常對(duì)照組

4 討論

CCl4是研究實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，可造成模型動(dòng)物脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA大量生成，氧自由基清除劑SOD水平明顯下降，造成的肝炎模型在形態(tài)學(xué)與病理學(xué)方面與人類肝損傷極為相似，因此，該模型已成為篩選和研究治療肝炎類藥物的經(jīng)典模型［10］。TTP可降低MDA量，提高肝組織中T-SOD活性，提示TTP可提高CCl4致急性肝損傷后小鼠的抗氧化能力，減輕肝細(xì)胞的變性壞死和炎性浸潤(rùn)等病理變化，并能夠降低肝臟系數(shù)。至于TTP對(duì)肝損傷的保護(hù)作用是否還存在其它機(jī)制，尚須進(jìn)一步深入研究。

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