李海芳， 孫 鵬， 迪麗努爾·沙比托夫， 楊玲玲， 閆明俞， 劉君康

(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所，新疆烏魯木齊830004)

蘇合香丸是著名的溫通開竅藥，被《中國藥典》收錄，現(xiàn)代臨床多用于中風所致的神志不清、牙關緊閉、半身不遂重癥，至今仍是搶救煤氣中毒和心肌梗塞、心絞痛的有效藥物。該藥處方中含有朱砂礦物藥材，由于歷史原因，該藥基礎研究薄弱，隨著中藥安全性問題日益引起重視，朱砂的毒性問題也引起了國內(nèi)外廣泛的關注［1-2］。因此，本實驗進行了大鼠口服蘇合香丸10 d后對其肝腎功能的影響及汞蓄積情況的研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 wistar大鼠，(150±30)g，雄性，清潔級。購于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK(新)2003-0001。

1.2 試藥 蘇合香丸(批號:JB65001、8010079、9010464、9010171)大蜜丸3 g/丸;朱砂細粉(本所藥材標本室提供)。

制備方法:取一丸蘇合香丸剪碎后，用5%羧甲基纖維素鈉溶液30 mL溶解，使用拍打式無菌均質器拍打180 s，制備成0.1 g/mL的混懸液;精密稱取朱砂細粉105 mg，加入5%羧甲基纖維素鈉溶液30 mL，制備成3.5 mg/mL的混懸液。每天臨用現(xiàn)配。

1.3 試劑 硝酸(優(yōu)級純，批號20100508，北京化工廠);硫酸(優(yōu)級純，批號20100508，北京化工廠);鹽酸(優(yōu)級純，批號100325，西安化學試劑廠);硼氫化鉀(優(yōu)級純，批號20100617，天津市光復精細化工研究所);氫氧化鉀(分析純，批號20070720，天津市福晨化學試劑廠);重鉻酸鉀(分析純，批號20030407，天津市化學試劑三廠)。

1.4 標準品 汞單元素標準溶液(GBW 086178094，標準值1000 μg/mL，中國計量科學研究院);魚肉中的總汞與甲基汞含量標準物質［GBW 100290801，總汞標準值(0.85±0.03)mg/kg，甲基汞標準值(0.84 ±0.03)mg/kg，中國計量科學研究院］。

1.5 儀器 組織勻漿機(D-130，WIGGEN HAUSER);低溫冰箱(型號MDF-U333，三洋醫(yī)用生物電子有限公司);低溫高速離心機(SIGMA3K15型，德國SIGMA公司);電子天平(BP221S，北京賽多利斯天平有限公司);拍打式無菌均質器(BD-400，南京貝帝實驗儀器有限公司);雙道原子熒光光度計(AFS-830a，北京吉天儀器有限公司)。智能電熱消解儀(型號LabTach，萊伯泰科公司)。

2 實驗方法和檢測指標

2.1 試驗分組 wistar大鼠，60只，隨機分為6組，即陰性組、蘇合香丸Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組、朱砂組。陰性組灌胃給予等容量的5%羧甲基纖維素鈉溶液;蘇合香丸Ⅰ組(批號8010079)、Ⅱ組(批號9010464)、Ⅲ組(批號 9010171)、Ⅳ組(批號JB65001)、朱砂組分別灌胃給予相應組的供試液0.5 mL/100 g。每天一次，連續(xù)灌胃10 d。

2.2 檢測指標

2.2.1 肝腎功能相關血生化指標檢驗 最后一次給藥后，所有大鼠禁食不禁水18 h，稱量體質量后，25%烏拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血離心制備血清進行谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血清胱抑素、尿素氮、肌酐的檢驗。同時小心剝?nèi)〈笫蟾闻K及腎臟并稱質量，計算臟器系數(shù)。

2.2.2 組織病理學檢查 右腎及剩余肝臟組織浸泡于10%甲醛溶液中備用進行組織病理學檢查。

2.2.3 肝腎組織中總汞的測定 取所有大鼠的左腎及部分肝臟組織使用雙道原子熒光光度計檢測動物組織中總汞量。

3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

4 結果

4.1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對體質量的影響 大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10 d后的體質量增長正常，毛發(fā)光澤，經(jīng)統(tǒng)計檢驗各組較陰性對照組比較無顯著性差異。見表1。

表1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對體質量的影響(± s，n=10)

表1 大鼠口服蘇合香丸10 d后對體質量的影響(± s，n=10)

/g陰性組組別 初給藥體質量/g 10 d后體質量146.1 ±27.5 181.4 ±23.0蘇合香丸Ⅰ組 146.2 ±26.8 177.7 ±23.0蘇合香丸Ⅱ組 158.6 ±30.8 180.1 ±30.4蘇合香丸Ⅲ組 160.6 ±37.3 191.7 ±38.3蘇合香丸Ⅳ組 151.8 ±34.9 183.1 ±31.0朱砂組147.6 ±30.4 179.9 ±27.4

4.2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對肝、腎臟器系數(shù)的影響大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10 d后，解剖大鼠對心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進行肉眼觀察，結果發(fā)現(xiàn)各組均無明顯病變情況。稱量肝、腎組織的濕質量，按體質量折算臟器系數(shù)(臟器質量g/100 g體質量)，經(jīng)統(tǒng)計檢驗各組大鼠臟器系數(shù)較陰性對照組比較無顯著性差異。見表2。

4.3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對血液生化指標的影響大鼠口服蘇合香丸、朱砂粉10d后，用25%烏拉坦溶液(0.4 mL/100 g)腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血進行肝功能及腎功能相關血生化指標檢驗［3］。結果表明:朱砂組與陰性組比較肝功能及腎功能均有損傷跡象，即谷草轉氨酶、血清胱抑素、肌酐數(shù)值顯著性增高(P＜0.05);尿素氮數(shù)值與陰性組比較有顯著性降低(P＜0.05)。蘇合香丸各組肌酐數(shù)值與陰性組比較均有顯著性增高(P＜0.05，P＜0.01)，表明蘇和香丸在本實驗條件下對腎功能有一定影響。見表3。

表2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對大鼠肝腎臟器系數(shù)的影響(± s，n=10)

表2 大鼠口服蘇合香丸10 d后對大鼠肝腎臟器系數(shù)的影響(± s，n=10)

組別 肝臟g/(100 g體質量)腎臟g/(100 g體質量)2.74 ±0.23 0.63 ±0.05蘇合香丸Ⅰ組 2.77 ±0.25 0.63 ±0.05蘇合香丸Ⅱ組 2.75 ±0.26 0.65 ±0.07蘇合香丸Ⅲ組 2.68 ±0.17 0.61 ±0.06蘇合香丸Ⅳ組 2.65 ±0.13 0.63 ±0.04朱砂組陰性組2.60 ±0.17 0.61 ±0.05

表3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對大鼠血液生化指標的影響(± s，n=10)

表3 大鼠口服蘇合香丸10 d后對大鼠血液生化指標的影響(± s，n=10)

注:各組與陰性組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

組別 谷丙轉氨酶ALT/(U·L－1)谷草轉氨酶AST/(U·L－1)ALT/AST 血清胱抑素/(μg·mL－1)尿素氮BUN/(mmol·L －1)肌酐Cr/(μmol·L －1)BUN/Cr陰性組 76.90 ±39.83 229.40 ±99.93 3.06 ±0.94 1.08 ±0.22 11.09 ±0.86 36.10 ±6.37 0.31 ±0.05蘇合香丸Ⅰ組 75.40 ±13.75 243.30 ±57.97 3.27 ±0.66 1.59 ±0.45 10.94 ±1.24 47.50 ±8.46* 0.24 ±0.04＊＊＊蘇合香丸Ⅱ組 72.70 ±17.99 215.80 ±43.66 3.02 ±0.45 1.39 ±0.32 11.29 ±0.90 44.50 ±4.03＊＊ 0.26 ±0.03＊＊蘇合香丸Ⅲ組 64.70 ±25.11 223.90 ±63.51 3.62 ±0.83 1.46 ±0.35 10.89 ±1.22 43.90 ±6.90＊＊ 0.25 ±0.04＊＊蘇合香丸Ⅳ組 87.30 ±27.94 270.30 ±52.64 3.22 ±0.49 1.34 ±0.16 11.15 ±0.64 44.30 ±4.27＊＊ 0.26 ±0.03＊＊朱砂組 118.10 ±45.16 298.90 ±92.29*2.64 ±0.40 1.49 ±0.19* 10.19 ±0.92* 42.90 ±4.68* 0.24 ±0.04＊＊＊

4.4 大鼠口服蘇合香丸10 d后對肝腎組織病理學的影響大鼠解剖肉眼觀察各組大鼠肝、腎均未見明顯異常。毒性病理組織形態(tài)檢查結果顯示蘇合香丸各組、朱砂組與陰性對照組相比較均未見到有關的病理改變，在本次實驗條件下，各組均未對大鼠肝、腎造成病理性損傷。

4.5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝腎組織中總汞的測定［4］

4.5.1 樣品的處理方法［5］精密稱取大鼠肝臟和腎臟組織各0.5 g，分別置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能電熱消解儀中120℃恒溫消解3 h，放冷，加雙氧水0.5 mL，搖勻，消解 0.5 h，取出冷卻至室溫，用5%鹽酸加至聚丙烯消解管10 mL刻度處，搖勻。取1.0 mL，轉移至刻度管中加5%鹽酸定容至10 mL，搖勻后進行測定，同時做試劑空白。

4.5.2 大鼠肝腎組織中總汞測定方法學研究

4.5.2.1 儀器條件［6］光電倍增管負高壓270 V;燈電流(峰值)26 A;原子化器高度8 mm;載流液5%鹽酸溶液;還原劑為20 g/L KBH4+5 g/L KOH;載氣(Ar)流量300 mL/min;測量方式為標準曲線法。

4.5.2.2 標準曲線測定 吸取汞標準溶液1000 μg/mL，5.0 mL于100 mL 量瓶中，用5%HNO3(含 0.5 g/L K2Cr2O7，保護Hg2+不還原成單質汞而被玻皿吸附)溶液定容至刻度，搖勻。用5%鹽酸溶液稀釋至汞溶液質量濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L。按上述測定條件設置儀器參數(shù)，穩(wěn)定30 min后開始測定，記錄熒光強度，以質量濃度(μg/L)為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線。汞濃度在0～2.0 μg/L范圍內(nèi)，含量與熒光強度呈正相關，γ為0.9995。

4.5.2.3 標準物質魚肉(GBW 100290801)中的總汞回收率測定 稱取標準物質魚肉9份，每份約0.2 g，精密稱定后，置50 mL聚丙烯消解管中，加入硝酸∶硫酸(V/V，3∶1)4 mL，于智能電熱消解儀中120℃恒溫消解3 h，放冷，加雙氧水0.5 mL，搖勻，消解0.5 h，取出冷卻至室溫，用純水加至聚丙烯消解管10 mL刻度處，搖勻。取1.0 mL，轉移至刻度管中加5%鹽酸定容至10 mL，搖勻后進行測定，同時做試劑空白，測定結果均在標準值范圍內(nèi)，回收率達到要求，為0.82～0.88 mg/kg。

4.5.2.4 正常大鼠肝臟組織加標回收率測定 正常大鼠肝臟組織勻漿后稱取12份，每份約0.5 g，精密稱定后，置50 mL聚丙烯消解管中。1～3份用于測定肝臟組織中汞的濃度;4～6份(加標 A-1～3)加入0.5 μg/mL 汞標準溶液 0.04 mL;7～9份(加標 B-1～3)加入0.5 μg/mL 汞標準溶液 0.1 mL;10～12份(加標 C-1 ～3)加入 0.5 μg/mL 汞標準溶液0.16 mL，每份加入硝酸∶硫酸(V/V，3 ∶1)4 mL，按照前述樣品處理方法進行消解，消解液稀釋后進行測定，同時做試劑空白，測定結果各組回收率為107% ～122%。詳見表4。

表4 正常大鼠肝臟組織中汞加標回收實驗結果

4.5.2.5 精密度及檢出限 儀器檢測精密度為3.92%。儀器檢出限為0.0045 μg/L(相關系數(shù)0.9940，n=5)。方法檢出限為0.01355 μg/L。

4.5.3 計算 肝、腎組織中含汞量，代入下列公式計算:X=(C1－C0)×V/m。式中X:樣品中汞的質量分數(shù)(μg/g);C1:測定樣液中汞的含有量(μg/L);C0:試劑空白中汞的含有量(μg/L);v:為樣品消解定容后總體積;m為樣品稱樣量(g)。

4.5.4 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中汞測定 將消解好的樣品稀釋后進行檢測，檢測結果表明:大鼠口服蘇合香丸10 d后與陰性組比較，在肝臟和腎臟均有明顯的蓄積，且在腎臟的蓄積更為顯著。具體見表5。

表5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中含汞量(± s，n=10)

表5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎組織中含汞量(± s，n=10)

注:各組與陰性組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

組別 肝臟中汞/(μg·g－1) 腎臟中汞/(μg·g－1)陰性組0.0944 ±0.0343 0.0644 ±0.0267蘇合香丸Ⅰ組 0.1049 ±0.0224 0.2335 ±0.0444＊＊＊蘇合香丸Ⅱ組 0.1419±0.0319＊＊＊ 0.3099±0.1166＊＊＊蘇合香丸Ⅲ組 0.1382 ±0.0357* 0.3018 ±0.1290＊＊＊蘇合香丸Ⅳ組 0.1342 ±0.0286* 0.3148 ±0.0656＊＊＊朱砂組 0.1756 ±0.0328＊＊＊ 0.3876 ±0.1090＊＊＊

4.5.5 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎中總汞蓄積率測定經(jīng)前期測定［7］，得知實驗各批號蘇合香丸中成藥的總汞量，計算每克組織中的汞蓄積率，發(fā)現(xiàn)汞在腎臟組織蓄積高于在肝臟組織的蓄積。計算公式:每克組織中汞蓄積率(‰)=每克組織中汞量×1000/(大鼠日服用量×蘇合香丸總汞量×10)。具體結果見表6。

表6 大鼠口服蘇合香丸10 d后肝、腎中總汞蓄積率測定結果

5 討論

汞的毒性已眾所周知，以硫化汞為主要成分的朱砂的毒性也已引起人們的高度警惕和重視。但目前仍有大量的中藥成方制劑含有朱砂［8］，這些制劑多以經(jīng)典方為主，由于歷史原因，這些制劑的基礎研究非常薄弱。由于我國開展重金屬限量標準的研究工作較晚，目前僅對部分中藥產(chǎn)品中的Pb、Hg、As等量作了限制，對大多數(shù)中藥(包括中藥生藥、制劑、提取物)目前尚未制定和完善其限量標準［9］。我國對《中國藥典》中的朱砂劑量進行過修訂，如1990年版及以往的歷版藥典朱砂日用劑量較大，為0.3～1.5 g，1995年版將朱砂劑量降至0.1～0.5 g，至2010年版仍為該限定劑量。2005年版《中國藥典》收錄的含朱砂的成方制劑達46個，占《中國藥典》收載制劑的8.1%;2010年版《中國藥典》收錄的含朱砂的成方制劑達54個，占《中國藥典》收載制劑的5.1%。鑒于含有朱砂的成方制劑在《中國藥典》占有相當?shù)臄?shù)量，所涉及的制劑及其功能主治、臨床適應癥數(shù)量、種類繁多，重新評價朱砂在成方制劑中的毒性和應用價值的工作就凸顯出了迫切性。

蘇合香丸是含有朱砂的成方制劑，目前被《中國藥典》收錄。我們對其進行了大鼠口服10 d的毒性評價工作。發(fā)現(xiàn)大鼠口服蘇合香丸后對其體質量、肝腎器官臟器系數(shù)沒有影響;血生化檢驗中未發(fā)現(xiàn)其對肝功能敏感指標谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶有影響，對腎功能敏感指標血清胱抑素、尿素氮、肌酐檢驗后發(fā)現(xiàn)服藥組肌酐數(shù)值與陰性組比較均有顯著性增高(P＜0.05)，但數(shù)值仍在正常值范圍內(nèi);病理組織形態(tài)學檢查顯示該藥品在10 d飼喂后未造成大鼠肝腎組織病理性損傷;經(jīng)雙道原子熒光光度計測定組織中的總汞，發(fā)現(xiàn)在肝腎組織中有汞蓄積現(xiàn)象，且在腎臟的蓄積率遠遠高于肝臟。

在本實驗中選擇的大鼠灌胃劑量為臨床人用最大劑量，在該劑量下服用10 d即可顯示出肌酐數(shù)值出現(xiàn)增高趨勢。如果超劑量服用或超時服用，依據(jù)本次實驗結果提示可能會引起肌酐數(shù)值的進一步增高，可能會超過正常值范圍甚至產(chǎn)生病理性損傷。

汞的靈敏度非常高，因此需要特別注意來自各方面的污染［10-11］。實驗中用到的所有器皿必須經(jīng)過20%HNO3(V∶V)浸泡過夜，并用去離子水清洗干凈后方能使用。通常分析純試劑中可能會含有少量汞，影響實驗測定結果，尤其是鹽酸，故所有試劑應盡可能采用優(yōu)級純，同時要作試劑空白用來扣除試劑帶來的影響。

另外，考慮到大鼠性別差異對血生化數(shù)值的影響［12］，本次研究僅選擇同一性別的大鼠進行了實驗。

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