糖類物質(zhì)是煙草中的一類重要化合物，煙草中的水溶性糖，特別是還原糖是影響煙草吸味的最重要化學成分之一。煙草中的水溶性糖與煙草的香味、吃味及焦油生成量密切相關(guān)。不同類型、不同產(chǎn)地的煙草，其水溶性糖的含量大小不同，導致了煙草品質(zhì)間的相關(guān)差異。糖類化合物的分析方法主要有比色法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法等。近年來，高效液相色譜法在糖類化合物的分離分析中有了很大的發(fā)展，該法具有快速、簡便、準確、分離效果好、不破壞樣品等優(yōu)點，成為分析糖類化合物的主要方法。由于糖類化合物在正常的紫外區(qū)和可見光區(qū)沒有吸收，也無熒光吸收，可用的液相色譜檢測器是示差折光和蒸發(fā)光散射兩種，定量分析中用得最多的檢測方法是示差檢測法。在煙草分析中，液相色譜分析糖相關(guān)的色譜固定相、預處理和檢測器等方面都有許多研究報道，并在實際工作中得到了廣泛應用。

本實驗建立了水超聲萃取-固相萃取-示差折光檢測的高效液相色譜法，用來測定煙草中的可溶性糖。該方法是以Waters Carbohydrate糖分析柱為分離中心，通過示差折光檢測器完成定性定量分析；樣品預處理采用超聲萃取和固相微萃取小柱過濾；能定性定量分離分析煙草中木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖等6種重要的糖。

一、材料與方法

1.主要儀器與試劑Shimadzu型液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），配有兩個LC-10ATvp泵、SIL-10ADvp型自動進樣器、shimadzuRID-10A示差折光檢測器、SCL-10Avp系統(tǒng)控制器和Shimadzu Class-VP色譜工作站。蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和木糖標準品（>99%，AlfaAesar公司），色譜純乙腈、色譜純乙腈（Tedia公司）；DZG-303A超純水系統(tǒng)（艾柯公司）、0.45μm微膜過濾器 (天津威騰公司）；Carbohydrate Analysis糖分析柱（3.9mm×300mm，5μm，Waters公 司 )，Waters Sep Pak-C18固相萃取小柱。

2.色譜條件 色譜柱：Carbohydrate Analysis糖分析柱（3.9 mm×300 mm，5 μm，Waters公司)，流動相為75%乙腈/水溶液，流速為0.6 ml/分鐘，柱溫35℃；進樣量 25 μl。

3.樣品處理 準確稱取煙草樣品約0.25 g，用25 ml水在35℃下超聲萃取30分鐘，過濾，棄去最初的約2 ml濾液，收集后面的濾液。取5 ml通過預活化好的Sep-PakC18固相萃取小柱，棄去最初的2 ml，收集后面的2 ml用4.5 μm濾膜過濾，取25 μl進樣分析。

4.分析方法

（1）標準曲線的制備 用超純水配制木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖混標，濃度為5.0 mg/ml。逐級稀釋配制得質(zhì)量濃度為 5.0，2.5，1.0，0.5，0.2，0.1mg/ml（麥芽糖等比例稀釋）的6個混合標準溶液。進色譜系統(tǒng)分析，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸計算，6個糖的回歸方程及線性范圍見表。

（2）加標回收和重現(xiàn)性試驗 精密量取已知含量的樣品適量，加入高、中、低3個不同濃度的混標，進樣測定，計算各種類糖的平均回收率；已知含量的樣品進樣6次計算重復性指標RSD。

（3）樣品測定和檢測限測定 樣品測定按外標法定量。以5倍信噪比作最低定量標準，由對應峰面積計算。

二、結(jié)果與討論

1.流動相的選擇 根據(jù)色譜柱說明書，Carbohydrate Analysis糖分析柱一般選用70%～80%乙腈/水作流動相。通過試驗優(yōu)化，選用75%乙腈/水能達到7種目標糖的最優(yōu)化分離，故實驗選用作流動相為75%乙腈/水。

2.樣品預處理 糖易溶于水，因此本實驗選用水浸取樣品中的糖，用超聲浸取效果優(yōu)于振蕩浸取，因此實驗選用超聲萃取。實驗表明，用30 ml水超聲浸取30分鐘，可使樣品中的糖達到較高的提取率和適當?shù)臐舛?，因此實驗選用超聲萃取20分鐘。萃取液中除了糖外，還含有其他干擾組分，如色素、多酚、有機酸、脂類物質(zhì)等，這些類物質(zhì)相對于糖疏水性強，易附著在分離材料上不被流動相洗脫而降低柱效，影響分離分析，所以在進樣之前要預去除這些成分。本實驗采用Sep-PakC18固相萃取小柱固相萃取預分離，樣品通過小柱時糖類由于親水性極強，在柱上沒有保留，而色素、多酚、脂類物質(zhì)等相對于測定組分疏水性較強，吸附在在小柱上,這樣過柱可除去色素、多酚、脂類物質(zhì)等。

小柱活化和樣品富集的流速均為1.0ml/分鐘，小柱用3ml甲醇活化，再用6ml水洗去甲醇,樣品加上小柱,棄去最初的2ml，收集后面的2ml，用4.5μm濾膜過濾，取25μl進樣分析。這樣可簡便、快速地除去色素、多酚及脂類物質(zhì)等干擾成分。

3.實際樣品含糖量與分離度的關(guān)系本實驗最后用示差折光檢測器能定性定量檢測煙葉中的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖等6種重要的糖，能分離的6種糖在較低濃度樣品中的分離度較在高濃度樣品中的分離度要好，經(jīng)實驗，殺青煙葉用30ml水萃取煙草樣品約0.25 g較合適，進樣量為25μl。

表1 16種糖HPLC分析方法的線性、回收率和重復性指標

4.結(jié)論 本實驗方法先用純水超聲萃取，再固相萃取預分離干擾組分，用Carbohydrate Analysis糖分析柱高效液相分離，最后用示差折光檢測器能定性定量檢測煙葉中的木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖等6種重要的糖。所建立的方法應用于殺青煙葉中水溶性糖的分析，獲得了良好的定性定量結(jié)果。