王惟帥，吳濟(jì)南，張?zhí)鞂?，杜慧?/p>

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

苯磺?。═ribenuron-methly）是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型磺酰脲類除草劑，于20世紀(jì)80年代由美國(guó)杜邦公司開發(fā)，具有高效、廣譜、低殘留、用量少等優(yōu)點(diǎn)，是目前廣泛用于麥田雜草防治的除草劑之一。苯磺隆曾被認(rèn)為是一種易降解且在生態(tài)環(huán)境中無殘留的農(nóng)藥[1-2]。然而，后來有研究發(fā)現(xiàn)，由于其對(duì)光、熱穩(wěn)定以及長(zhǎng)期大量使用，給環(huán)境造成了土壤—水體—生物—大氣各層面直接、復(fù)合交叉和循環(huán)式的立體污染，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡造成不利影響[3]。利用微生物代謝多樣性的特點(diǎn)對(duì)受污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)，是解決農(nóng)藥污染的重要途徑[4-6]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于苯磺隆的研究主要集中在藥效、殘留分析方法及其對(duì)植物生理特性的影響等方面[7-10]。而苯磺隆的生物降解以及苯磺隆降解菌生物學(xué)特性的研究鮮見報(bào)道[11-13]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室從長(zhǎng)期使用苯磺隆的污染土壤中，分離得到1株苯磺隆降解菌株，命名為BHL。本試驗(yàn)以其為研究對(duì)象，進(jìn)行生長(zhǎng)條件特性的研究，旨在為苯磺隆降解菌的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MM）組成為 ：MgSO4·7H2O 0.2 g/L；FeCl30.05 g/L；K2HPO41.0g/L；KH2PO41.0g/L；NaCl0.5g/L；CaCl20.02 g/L；NH4NO31.0 g/L；pH 值 7.0～7.5。

1.1.2 供試菌株和農(nóng)藥 苯磺隆降解菌株BHL由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離獲得，苯磺隆原藥（純度95%）由中國(guó)沈陽(yáng)化工研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株生長(zhǎng)量測(cè)定 降解菌株經(jīng)無菌水洗滌2次后，接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH值7.0）中，使菌濃度達(dá)106個(gè)/mL，30℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣，于OD600測(cè)定降解菌株BHL的生長(zhǎng)情況。3次重復(fù)。

1.2.2 培養(yǎng)基初始pH值和Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響 分別以初始pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 和 Mg2+質(zhì)量濃度 100，200，300，400，500 mg/L為試驗(yàn)組，將含苯磺隆100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基 （菌濃度大約達(dá)106個(gè)/mL）盛于250 mL三角瓶中，接種經(jīng)活化24 h、磷酸緩沖液洗滌3次的降解菌株BHL后，30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，同1.2.1定時(shí)測(cè)定菌體的生長(zhǎng)量。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對(duì)照。

1.2.3 苯磺隆質(zhì)量濃度和溫度對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響 活化24 h的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于初始pH值為7.0，苯磺隆質(zhì)量濃度分別為 50，100，200，300，400，500 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中（菌濃度大約達(dá)106個(gè)/mL），30℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。測(cè)溫度的試驗(yàn)組則將接種好菌株的含苯磺隆100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基置于 10，20，30，40，50 ℃的條件下培養(yǎng)，同1.2.1定時(shí)測(cè)定菌體的生長(zhǎng)量。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置無菌為對(duì)照。

1.2.4 通氣量對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響 采用250 mL三角瓶分別盛有含苯磺隆100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基 20，30，50，70，90 mL，將活化 24 h 的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，接種于其中，于30℃，150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定菌體生長(zhǎng)量，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對(duì)照。菌體生長(zhǎng)量測(cè)定同1.2.1。

1.2.5 不同氮源、碳源對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響

活化24 h的降解菌株BHL經(jīng)磷酸緩沖液洗滌3次后，分別接種于以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆等為唯一氮源和以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，且所選的氮源、碳源質(zhì)量濃度均為100 mg/L（菌濃度大約達(dá)106個(gè)/mL），30℃，150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定菌體生長(zhǎng)量，每試驗(yàn)3次重復(fù)，并設(shè)置無菌為對(duì)照。菌體生長(zhǎng)量測(cè)定同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)降解菌株BHL生長(zhǎng)的影響

從圖1可以看出，在含有苯磺隆100 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，pH值在6.5～9.0范圍內(nèi)，菌株BHL均可以生長(zhǎng)。不同時(shí)間的OD600值隨著培養(yǎng)基初始pH的增加表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，OD600最大，說明菌株在pH值為7.0時(shí)，生長(zhǎng)最佳。

2.2 苯磺隆質(zhì)量濃度對(duì)降解菌株BHL生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，降解菌株BHL在苯磺隆質(zhì)量濃度為50～500 mg/L時(shí)均可以生長(zhǎng)。除50 mg/L外，其他質(zhì)量濃度處理均在第7天時(shí)OD600值達(dá)最大；當(dāng)苯磺隆濃度為100 mg/L時(shí)，不同時(shí)間的OD600值均為最大，說明菌株在苯磺隆質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)最好。

2.3 溫度對(duì)降解菌株BHL生長(zhǎng)的影響

從圖3可以看出，降解菌在所設(shè)的溫度條件下均可以生長(zhǎng)。隨著溫度的升高，OD600呈先增加后減少的變化趨勢(shì)；當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌株長(zhǎng)勢(shì)最好。

2.4 通氣量對(duì)降解菌株BHL生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，在250 mL的三角瓶中裝入20～90 mL培養(yǎng)液后，菌株BHL均可以生長(zhǎng)，但隨著培養(yǎng)基體積的增加，不同時(shí)間OD600呈先增加后減少的變化趨勢(shì)。當(dāng)裝液量為50 mL（1/5體積）時(shí)，降解菌株BHL的生長(zhǎng)最好。

2.5 Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響

從圖5可以看出，降解菌株BHL在供試Mg2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)。當(dāng)Mg2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)最佳。

2.6 不同氮源對(duì)降解菌株BHL生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，降解菌株BHL在以尿素、酵母膏、硝酸鈉和苯磺隆分別為唯一氮源的培養(yǎng)基中均可以生長(zhǎng)，生長(zhǎng)情況視不同氮源而異（酵母膏＞尿素＞苯磺?。鞠跛徕c）。從圖6可以看出，以酵母膏為氮源時(shí)，降解菌株BHL的生長(zhǎng)最好，OD600值明顯高于其他幾種氮源。苯磺隆作為唯一氮源時(shí)，菌株BHL可以生長(zhǎng)，與以尿素、硝酸鈉為氮源時(shí)生長(zhǎng)狀況差異不大。

2.7 不同碳源對(duì)菌株BHL生長(zhǎng)的影響

從圖7可以看出，以相同質(zhì)量濃度的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆分別為唯一碳源的培養(yǎng)基中，以葡萄糖為碳源時(shí)，降解菌株生長(zhǎng)情況較其他碳源要好。在所選碳源的培養(yǎng)基中，降解菌株雖都能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)情況較差，OD600值都在0.1以下。

3 討論與結(jié)論

土壤中農(nóng)藥的降解途徑，一般分為物理、化學(xué)與生物過程，而微生物降解與化學(xué)水解是其主要降解途徑。土壤環(huán)境中存在多種可以降解農(nóng)藥的微生物。近年來，國(guó)內(nèi)外研究者開展了生物強(qiáng)化修復(fù)農(nóng)藥的研究，通過富集培養(yǎng)、分離篩選等技術(shù)已經(jīng)篩選出很多能夠降解農(nóng)藥的微生物，應(yīng)用微生物進(jìn)行生物修復(fù)已成為環(huán)境修復(fù)的一個(gè)主要研究方向。生物修復(fù)技術(shù)主要是利用微生物的降解作用，將污染物分解并最終去除，它具有無毒、無殘留、無2次污染等優(yōu)點(diǎn)。而在修復(fù)過程中，外源降解菌的穩(wěn)定性、活性等因素是影響生物修復(fù)的關(guān)鍵因素。因此，當(dāng)引入外源降解菌對(duì)土壤進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，只有了解降解菌的生物學(xué)特性，才能通過人為調(diào)控的手段來促進(jìn)、強(qiáng)化生物修復(fù)，為提高農(nóng)藥的生物降解效率提供技術(shù)依據(jù)。有關(guān)磺酰脲類除草劑降解菌生長(zhǎng)特性等方面的研究報(bào)道相對(duì)較少[14-15]。

本試驗(yàn)對(duì)從長(zhǎng)期使用苯磺隆的田間土壤中分離得到的苯磺隆降解菌株生長(zhǎng)條件優(yōu)化研究表明，苯磺隆降解菌株BHL在pH值為6.5～9.0的范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，但以pH值為7.0時(shí)生長(zhǎng)最佳；苯磺隆質(zhì)量濃度對(duì)菌株BHL的生長(zhǎng)有一定的影響，其質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，菌株BHL生長(zhǎng)最好；10～50℃范圍內(nèi)降解菌可以生長(zhǎng)，但30℃時(shí)生長(zhǎng)最好；250 mL三角瓶，裝液量為20～90 mL菌株BHL均可以生長(zhǎng)，但裝液量為50 mL時(shí)菌株生長(zhǎng)狀況最好；Mg2+質(zhì)量濃度為100～500 mg/L的范圍內(nèi)，菌株均可以生長(zhǎng)，但當(dāng)Mg2+質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)，菌株BHL的生長(zhǎng)最佳。以100 mg/L尿素、酵母膏、硝酸鈉、苯磺隆為唯一氮源和以100 mg/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和苯磺隆為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，菌株BHL均可以生長(zhǎng)，其中，分別以酵母膏為碳源和以葡萄糖為氮源時(shí)，生長(zhǎng)最好；且以苯磺隆為唯一氮源或碳源菌株都能夠正常生長(zhǎng)。

苯磺隆降解菌生長(zhǎng)特性的研究，為利用生物手段修復(fù)苯磺隆污染土壤的研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。

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