史春生 金慧軍 趙君 王升志 毛祖彝

（1.煙臺(tái)市福山區(qū)人民醫(yī)院 口腔科，煙臺(tái) 265500；2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院 口腔頜面外科，煙臺(tái) 264000；3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)，成都 610041）

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療后的效果與機(jī)體的免疫功能狀態(tài)有著非常密切的關(guān)系。在腫瘤治療中，化療最大的問(wèn)題就是藥物對(duì)免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的損傷。熱化療作為一種很有前途的癌癥治療手段[1]，可以降解化療藥物的毒副作用[2]。學(xué)者們認(rèn)為其具有明顯的生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。熱化療除了直接殺傷腫瘤細(xì)胞以及增強(qiáng)局部化療藥效外[3]，還可以刺激免疫系統(tǒng)的功能，增加CD3+T、CD4+T細(xì)胞的數(shù)量，提高CD4+/CD8+的比值[5-6]。另外，細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤治療方面的價(jià)值日益受到人們的重視，其中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α在細(xì)胞因子抗腫瘤方面的作用有著非常重要的地位[7-8]，但目前關(guān)于熱化療后口腔癌宿主T細(xì)胞和細(xì)胞因子功能狀態(tài)的變化及其相互關(guān)系尚無(wú)系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究旨在通過(guò)對(duì)荷瘤鼠及口腔癌患者進(jìn)行不同處理，觀察熱化療對(duì)荷瘤宿主T細(xì)胞功能及IL-2和TNF-α水平變化的影響，探討T細(xì)胞和細(xì)胞因子功能狀態(tài)的變化間有無(wú)相關(guān)性，并進(jìn)一步探討熱化療引起荷瘤宿主免疫功能改變的機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

平陽(yáng)霉素（天津太河制藥有限公司），IL-2、TNF檢測(cè)試劑盒（Sigma公司，美國(guó)），501型超級(jí)恒溫器（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠），915型微波熱療機(jī)（成都錦江電機(jī)廠），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（DG-3022型，江蘇省華東電子管廠）。

1.2 小鼠腫瘤模型的建立和熱化療處理

選取四川省抗生素研究所提供的8周齡Balb/c純系小白鼠100只，雌雄各半。小白鼠分籠飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)平均分為5組，分別為正常對(duì)照組（N組）、不治療組（NT組）、平陽(yáng)霉素治療組（P組）、高溫治療組（H組）、高溫聯(lián)合平陽(yáng)霉素治療組（HP組），每組20只，雌雄各半。后4組為實(shí)驗(yàn)組，于開(kāi)始治療前48 h，經(jīng)同一人操作，在每只小鼠右后足底皮下注入S180細(xì)胞（0.1mL培養(yǎng)基中2×107個(gè)瘤細(xì)胞，腹水型，皮下接種后可生成實(shí)體型。由四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。接種瘤細(xì)胞48 h后，給P組和HP組小鼠腹腔注射平陽(yáng)霉素（0.1mL培養(yǎng)基含0.2mg）；HP組給藥后立即用恒溫水（42.0℃±0.2℃）加溫右后足荷瘤部位，歷時(shí)30min。H組接受與HP組相同的加溫處理。7 d后各治療組重復(fù)上一次治療。于第2次治療后15 d將動(dòng)物全部處死，完整剝離腫瘤稱(chēng)重，在無(wú)菌條件下取其脾臟，采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)（lymphocyte transformation index，LTI）及IL-2、TNF-α水平檢測(cè)。

1.3 臨床病例

選取2007年9月—2009年11月就診于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院熱療中心的20例口腔癌患者為研究對(duì)象。其中男性12人，女性8人。年齡42～70歲，平均56歲。被納入的20例患者均未經(jīng)任何治療，無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥和重復(fù)癌。其中唇癌12例，顏面皮膚癌8例。病理組織學(xué)診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，其中低分化4例，中分化10例，高分化6例。臨床分期為T(mén)2～T4。

1.4 患者的熱化療處理

對(duì)20例口腔癌患者給予每周2次（周二、五），5周10次一療程的熱化療處理。靜脈注射平陽(yáng)霉素8mg后，立即給予42.5℃±0.2℃、40min微波熱療。分別于第一次治療前和最后一次治療后采集外周靜脈血，用MTT法[5]測(cè)IL-2、TNF-α水平，并采用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)IL-2、TNF-α水平結(jié)果行組間兩兩比較LSD-t檢驗(yàn)；對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)LTI的結(jié)果按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多樣本均數(shù)間的兩兩比較作q檢驗(yàn)；對(duì)口腔癌患者熱化療前后LTI、T淋巴細(xì)胞亞群及IL-2、TNF-α水平行組間配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的抑瘤效果

經(jīng)熱化療后，HP組小鼠的抑瘤率達(dá)到83%，H組和P組的抑瘤率分別為50%和57%，HP組抑瘤效果明顯高于H組和P組（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠IL-2、TNF-α活性

各組小鼠IL-2、TNF-α活性的MTT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。第2次治療后15 d，HP組和N組、H組和P組、P組和NT組之間的IL-2值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組之間的IL-2值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TNF-α與之相同。

2.3 各組小鼠的LTI

第2次治療后15 d，各組小鼠LTI的MTT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，HP組、H組與N組小鼠的LTI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而P組和NT組與HP組、H組、N組的LTI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 20例口腔癌患者熱化療前后各檢測(cè)值的變化

20例口腔癌患者熱化療前后IL-2、TNF-α的活性以及LTI、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的變化見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，在熱化療后IL-2和TNF–α明顯升高（P＜0.01）；采用3H-TdR摻入法行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在熱化療后LTI、CD4+及CD4+/CD8+明顯升高（P＜0.01），而CD8+值無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

T淋巴細(xì)胞在腫瘤的免疫效應(yīng)中起著非常重要的作用，它不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而且能產(chǎn)生許多淋巴因子調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)[9-11]。T細(xì)胞分為CD4+和CD8+兩大亞群，按功能不同分為輔助性T細(xì)胞（help T cell，Th）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL或Tc）、抑制性T細(xì)胞（suppressor T cell，Ts）。CD4+T細(xì)胞主要是Th細(xì)胞，少數(shù)為CTL，其對(duì)抗體生成、巨噬細(xì)胞活化及CTL的活化有輔助、放大效應(yīng)，并通過(guò)它們發(fā)揮作用。Ts能通過(guò)抑制細(xì)胞免疫功能來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，正常狀態(tài)下保持著一定的數(shù)量及活性水平，當(dāng)發(fā)生腫瘤后，這類(lèi)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，抑制機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫效應(yīng)，從而使腫瘤逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。

細(xì)胞因子在與靶細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合后發(fā)揮免疫功能作用。腫瘤可通過(guò)各種不同途徑來(lái)影響機(jī)體的免疫功能，使荷瘤宿主呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，其中一種是腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），它可以抑制IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞和IL-2受體的表達(dá)，抑制T細(xì)胞活化，從而抑制IL-2的分泌；而腫瘤細(xì)胞分泌的前列腺素（prostaglandin，PG）也能使IL-2受到抑制。腫瘤使巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞受到抑制，從而使TNF-α分泌減少。

近幾年國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，癌癥患者外周血T細(xì)胞亞群有著明顯的變化，CD4+細(xì)胞（Th）減少，CD8+細(xì)胞（Ts和Tc）增多，CD4+/CD8+比值下降或倒置，且這種變化隨著腫瘤的進(jìn)展愈加明顯[12-15]。其機(jī)理是腫瘤通過(guò)表達(dá)、釋放某種腫瘤抗原或其他可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)激活Ts細(xì)胞，從而參與機(jī)體的免疫抑制[4]。而在本文動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，NT組和P組由于免疫系統(tǒng)的抑制，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)及產(chǎn)生的IL-2、TNF活性下降，與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；HP組由于受到熱療和化療的作用，LTI及IL-2、TNF-α活性均升高，與NT及P組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而與N組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。臨床實(shí)驗(yàn)中，口腔癌患者IL-2、TNF-α水平以及LTI、CD4+和CD4+/CD8+在熱化療后明顯升高（P＜0.01）。表明熱化療后可使荷瘤機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)得以解除，機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，LTI及其產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力均提高，從而機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)。同時(shí)該結(jié)果也提示熱化療組不會(huì)因?yàn)榛熕幬锏母弊饔枚档蜏責(zé)釋?duì)淋巴細(xì)胞功能的影響，也不會(huì)由于溫?zé)徇^(guò)度刺激免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫功能的紊亂。

IL-2在腫瘤免疫中作為最重要的細(xì)胞因子之一，具有以下功能：1）增強(qiáng)T細(xì)胞功能[16]，IL-2是T細(xì)胞最重要的生長(zhǎng)因子，能直接或間接促T細(xì)胞的增殖活化，誘導(dǎo)CTL，維持T細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞因子的產(chǎn)生，通過(guò)活化CTL或Th發(fā)揮抗癌作用；2）誘導(dǎo)和增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞、CTL的活性[17]；3）誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子；4）增強(qiáng)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[18]。本實(shí)驗(yàn)荷瘤鼠以及口腔癌患者熱化療后，IL-2、LTI、CD4+及CD4+/CD8+明顯升高，呈現(xiàn)相同變化趨勢(shì)，從而進(jìn)一步證明了IL-2能直接或間接促進(jìn)T細(xì)胞的增殖活化，而活化的T細(xì)胞可以繼續(xù)分泌細(xì)胞因子，協(xié)同增強(qiáng)免疫功能，二者之間存在著緊密的聯(lián)系。

綜上所述，熱化療后可使荷瘤宿主者免疫抑制狀態(tài)得以解除，同時(shí)能降低化療藥物對(duì)機(jī)體免疫功能損傷的毒副作用，LTI升高，Th增多，IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子活性增強(qiáng)，從而使機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答加強(qiáng)。

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