凌光輝 唐文彬 孫 林 彭佑銘 段紹斌 劉 虹 李 瑛 劉映紅 劉伏友

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)最常見的原因之一。腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是DN發(fā)展到ESRD的最主要病理改變,而細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積是腎間質(zhì)纖維化的主要組織學(xué)改變。高糖導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞ECM沉積增加,轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)在這一過程中起關(guān)鍵作用[1]。TGF-β1/Smads信號通路是經(jīng)典的TGF-β1細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑,受多個(gè)因素調(diào)控。Smad錨著蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)是TGF-β1/Smad信號通路的銜接蛋白。SARA可呈遞Smad2和Smad3至活化的TGF-βⅠ型受體(TβⅠR),促進(jìn)其磷酸化,介導(dǎo)TGF-β1信號由其受體活化到核轉(zhuǎn)位的過程。已有研究提示SARA可能參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及纖維化,但具體機(jī)制不詳[2]。本研究旨在探討SARA在高葡萄糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積中的作用及機(jī)制。

材料與方法

材料與試劑DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胰酶(美國Sigma公司),胎牛血清(中國杭州四季青公司),D-葡萄糖(美國Sigma公司),D-甘露醇(美國Sigma公司),小鼠抗人Ⅰ型膠原(CollagenⅠ,ColⅠ)單克隆抗體(英國Abcam公司),兔抗人纖維連接蛋白(FN)多克隆抗體(美國Sigma公司),山羊抗人SARA多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),兔抗人SARA多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),兔抗人TGF-β1多克隆抗體(美國Cell signaling公司),小鼠抗人Smad2單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),兔抗人Smad3抗體(美國Cell signaling公司),兔抗人p-Smad2多克隆抗體(美國milipore公司),兔抗人p-Smad3多克隆抗體(美國R&D公司),小鼠抗人β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠二抗、抗兔二抗、抗山羊二抗(中國中杉金橋公司),Trizol(美國Invitrogen公司)、組織細(xì)胞蛋白裂解液RIPA(北京鼎國生物公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)(立陶宛Fermentas公司),PCR引物(由上海生物工程公司合成),SYBR Green ER qPCR SuperMix(美國Invitrogen公司),ECL顯影劑,PVDF膜(美國Millipore公司)。脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司),Opti-MEMⅠ培養(yǎng)基(美國Gibco公司),質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化科技有限公司),高純度質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司),質(zhì)粒pCMV5B-FLAG-SARA和pCMV5B-FLAG-SARA dSBD(美國Addgene)。

細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)正常人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)(購自ATCC)使用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基,37℃、5%CO2條件下生長。細(xì)胞長至80%以上融合時(shí)進(jìn)行消化,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/ml接種到六孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。D-葡萄糖刺激時(shí)間的選擇:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3],并結(jié)合本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用30 mmol/L D-葡萄糖作為干預(yù)條件。D-葡萄糖刺激0h,24h,48h及72h提取總蛋白和RNA。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具體操作參考脂質(zhì)體2 000說明書進(jìn)行。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞分組如下:(1)未轉(zhuǎn)染HK-2+5.5 mmol/L葡萄糖(正常對照組,LG)；(2)未轉(zhuǎn)染HK-2+30 mmol/L D-葡萄糖(高糖組,HG)；(3)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV5B-FLAG-SARA的HK-2+30 mmol/L D-葡萄糖[高糖組+SARA(WT)組]；(4)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV5B-FLAG-SARA dSBD(敲除SBD結(jié)構(gòu)域)的HK-2+30mmol/L D-葡萄糖[高糖+SARA(dSBD)組]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后再加高糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激,高糖刺激48h后提取總蛋白及RNA。

細(xì)胞免疫熒光將細(xì)胞直接培養(yǎng)于24孔板蓋玻片上,同步12h后,進(jìn)行分組誘導(dǎo)；將孔板中蓋玻片上的細(xì)胞用PBS快速清洗2次；4%多聚甲醛室溫固定15～20 min；PBS清洗3次；0.1%PBST室溫孵育3～5 min；PBS清洗3次；加入稀釋的一抗后置于37℃恒溫?fù)u床上孵育1h(孔間加水保濕)；PBS清洗3次；滴加稀釋的FITC標(biāo)記相應(yīng)二抗,37℃孵育1h；PBS清洗3次；滴加稀釋的DAPI；封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并且拍照；陰性對照用PBS代替一抗以排除非特異性的二抗結(jié)合。

Western Blot 將HK-2細(xì)胞加入100 μl預(yù)冷的組織細(xì)胞裂解液(使用前加入1∶100的PMSF)冰上裂解30 min。裂解液4℃、12 000 r/min離心10 min,上清移入另一1.5 ml EP管中,用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取變性的蛋白20 μg/孔,用相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳。恒壓下將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,3%牛血清白蛋白封閉2h,分別加入稀釋的一抗,37℃孵育2h或4℃過夜。PBST洗膜3次,加入對應(yīng)的HRP標(biāo)記IgG,孵育1h。PBST洗膜3次后顯影,將PVDF膜固定在Kodak暗箱,Kodak IS4000凝膠成像分析系統(tǒng)曝光掃描并且分析結(jié)果,以所測得的各條帶的吸光度與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值代表定量值。

實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR) 按Trizol試劑說明書提取不同組HK-2細(xì)胞總RNA。按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得cDNA進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)總體系25 μl,包括雙蒸水9.5 μl,cDNA 2 μl,SYBR green 染料12.5 μl,上下游引物各0.5 μl。引物見表1,引物均由上海生物工程公司合成。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,隨后40循環(huán),包括95℃變性15s,60℃退火并延伸40s。每個(gè)基因設(shè)3復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用雙ΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量,每個(gè)樣品目的基因表達(dá)量除以β-actin表達(dá)量即為樣品基因相對含量。

表1 各基因引物序列

結(jié) 果

高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM分泌增加Western Blot結(jié)果顯示,高糖刺激后,HK-2細(xì)胞FN表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加,刺激24h后其表達(dá)增加,刺激48h后有顯著性差異(P<0.01),72h達(dá)到高峰,而ColⅠ也有相同的變化(圖1A、B)。Real-time PCR檢測也提示高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM中FN和ColⅠα1 mRNA表達(dá)水平增加,48～72h其表達(dá)量達(dá)到高峰,與0h相比有顯著性差異(P<0.01)(圖1C)。

圖1 高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM分泌增加

高糖誘導(dǎo)TGF-β1信號通路活化

高糖誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá)上調(diào) Western Blot結(jié)果顯示,高糖刺激后,HK-2細(xì)胞TGF-β1表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加,48h有顯著性差異(P<0.01),72h時(shí)達(dá)到高峰(圖2A、B)。Real-time PCR結(jié)果也提示高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)上調(diào),呈時(shí)間依賴性(圖2C)。

圖2 高糖對HK-2細(xì)胞TGF-β1、Smad2及Smad3表達(dá)水平的影響

高糖誘導(dǎo)Smad2和Smad3表達(dá)水平變化 進(jìn)而檢測高糖刺激后Smad2和Smad3的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn),高糖可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Smad3蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加,刺激48h后有顯著性差異(P<0.01)(圖2A、B),Real-time PCR結(jié)果亦證實(shí)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Smad3 mRNA表達(dá)上調(diào)(圖2C)。而高糖刺激后,HK-2細(xì)胞Smad2 mRNA表達(dá)升高,與低糖組相比,高糖刺激48h有顯著性差異(P<0.01)(圖2C),但Smad2蛋白水平呈時(shí)間依賴性降低(圖2A,B),即Smad2蛋白水平變化與mRNA水平變化不一致。提示高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM沉積過程中,Smad2和Smad3可能發(fā)揮了不同的作用。

高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Smad2和Smad3磷酸化Western Blot結(jié)果提示,高糖刺激30min后,p-Smad2表達(dá)明顯增高(P<0.05),持續(xù)至60 min,90 min起即下降。高糖刺激30 min起,p-Smad3的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)并持續(xù)至120 min。可見高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM沉積過程中,TGF-β1信號通路發(fā)生活化,且以Smad3的活化為主(圖3)。

圖3 高糖刺激HK-2細(xì)胞Smad2和Smad3不同程度的磷酸化

高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞SARA表達(dá)下降細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:低糖組HK-2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有均勻、顆粒狀的SARA表達(dá),高糖刺激48h后,SARA表達(dá)明顯下降(圖4A)。Western Blot結(jié)果顯示,高糖刺激后,HK-2細(xì)胞SARA表達(dá)下調(diào),24h即有顯著性差異(P<0.01),48～72h進(jìn)一步下降(圖4B、C)。Real-time PCR檢測結(jié)果也提示SARA的mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性下調(diào),24～48h有顯著性差異(圖4D)。

圖4 高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞SARA表達(dá)下降

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測SARA的表達(dá)。結(jié)果顯示,SARA(WT)和SARA(dSBD)質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞SARA表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組明顯增高(P<0.05),而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒對SARA的表達(dá)無影響(圖5)。

圖5 HK-2細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果鑒定

過表達(dá)SARA抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積轉(zhuǎn)染質(zhì)粒SARA(WT)或SARA(dSBD)48h后,再予高糖刺激48h,提取總蛋白及RNA,檢測FN、ColⅠ的蛋白及mRNA的表達(dá)水平變化。Western Blot結(jié)果顯示,高糖組FN和ColⅠ蛋白表達(dá)水平較低糖組明顯上調(diào)(P<0.01)；高糖+SARA(WT)組FN和ColⅠ蛋白表達(dá)較高糖組有明顯下調(diào)(P<0.05)；而高糖+SARA(dSBD)組FN和ColⅠ蛋白表達(dá)水平較高糖組無明顯變化(P>0.05)(圖6A,B)。Real-time PCR結(jié)果也提示與高糖組比較,高糖+SARA(WT)組FN和ColⅠα1 mRNA表達(dá)水平有所下降(P<0.05),而高糖+SARA(dSBD)組FN和ColⅠα1 mRNA表達(dá)水平無明顯變化(圖6C)。以上結(jié)果提示過表達(dá)SARA可抑制HK-2細(xì)胞ECM沉積,這一效應(yīng)依賴于SARA的SBD結(jié)構(gòu)域。

討 論

ECM沉積是DN腎臟纖維化的特征性改變之一。在高糖環(huán)境中,尤其是細(xì)胞內(nèi)的高糖可促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、近端腎小管上皮細(xì)胞等肥大,并使腎臟多種ECM成分如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型膠原、FN及蛋白多糖合成增加。另一方面,高糖可導(dǎo)致ECM降解失常[4]。本研究檢測了FN和ColⅠ的蛋白和mRNA表達(dá)變化,結(jié)果提示高糖可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM成分FN和ColⅠ呈時(shí)間依賴性增加,mRNA表達(dá)變化尤為明顯。

TGF-β1是DN發(fā)病過程中的核心因子,其他因子可通過調(diào)節(jié)TGF-β1的生成來影響DN進(jìn)展[5,6]。糖尿病時(shí)TGF-β1及其受體mRNA表達(dá)上調(diào)[7,8],TGF-β1的受體主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞,成為體內(nèi)這種促纖維化因子的主要靶細(xì)胞。本研究也發(fā)現(xiàn)高糖刺激24h,HK-2細(xì)胞TGF-β1的mRNA表達(dá)明顯增高,48～72h后蛋白表達(dá)達(dá)穩(wěn)定高值,這與高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積相一致,提示TGF-β1在這一過程中發(fā)揮了重要的作用。

Smad2、Smad3雖同屬R-Smads,是主要的TGF-β1細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑,但兩者在不同的疾病狀態(tài)、不同的細(xì)胞系表現(xiàn)出不同的變化,發(fā)揮不同的功能,Smad3可能是關(guān)鍵的致纖維化因子,而Smad2在轉(zhuǎn)分化及纖維化中的作用一直存在爭議[9]。Ju等[10]特異性敲除肝臟細(xì)胞的Smad2、Smad3或?qū)烧咄瑫r(shí)敲除,再構(gòu)建肝臟纖維化模型發(fā)現(xiàn),敲除Smad2的小鼠表現(xiàn)出更為明顯的肝臟纖維化,體外實(shí)驗(yàn)也表明敲除Smad2后,肝細(xì)胞在TGF-β1的刺激下發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)分化,而敲除Smad3后,可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[10]。在本研究中,高糖可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞Smad2蛋白表達(dá)下調(diào),而Smad3蛋白和mRNA水平上調(diào)。提示Smad3可能作為主要的促進(jìn)因子參與了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積,而Smad2的下降打破了兩者的平衡,促進(jìn)了HK-2細(xì)胞ECM沉積的進(jìn)展。更有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)高糖刺激后Smad2的mRNA表達(dá)水平上調(diào),而其蛋白水平下降,提示存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制調(diào)控了Smad2的蛋白表達(dá)。目前研究認(rèn)為泛素蛋白酶體通路成員Smurf2可與Smad2結(jié)合,使其發(fā)生泛素化降解[2]。我們推測其他轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制如某些microRNA分子也可能參與調(diào)節(jié)Smad2,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。

SARA是TGF-β1信號通路中重要的銜接蛋白,近年來在TGF-β1/Smad通路中的調(diào)控作用逐漸被重視。已有研究提示SARA可能與EMT及纖維化相關(guān)。Tao等[11]研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化時(shí)SARA的表達(dá)水平與TGF-β1及α平滑肌肌動蛋白呈負(fù)相關(guān),即肝臟纖維化時(shí)SARA表達(dá)水平會下降。在體外肝臟星形細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程中,SARA主要表達(dá)于靜止的肝臟星形細(xì)胞,而非活化的肝臟星形細(xì)胞[12]。近期有研究者發(fā)現(xiàn),SARA可維持上皮細(xì)胞的形態(tài),表達(dá)降低后可引起上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[2]。本研究中,我們用細(xì)胞免疫熒光檢測了SARA在HK-2細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)高糖可明顯抑制SARA的表達(dá)。Western Blot和Real-time PCR進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性降低,與高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞ECM分泌呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示SARA可能作為一種保護(hù)因子參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積過程。過表達(dá)SARA可抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM分泌,而轉(zhuǎn)染SARA(dSBD)無此效應(yīng)。結(jié)果提示SARA的SBD結(jié)構(gòu)域在其調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM分泌的過程中起關(guān)鍵作用。

SARA在細(xì)胞內(nèi)可直接與Smad2相結(jié)合,調(diào)節(jié)Smad2的細(xì)胞內(nèi)定位,使其被活化的TGF-β1受體激活,介導(dǎo)TGF-β1信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。SBD結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)SARA與Smad2/3直接結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。本研究發(fā)現(xiàn)高糖刺激后SARA表達(dá)下降,提示SARA與Smad2的蛋白表達(dá)變化相一致,而與Smad3的表達(dá)變化相反。最新的研究表明SARA的下調(diào)可促進(jìn)了Smad2與Smurf2的結(jié)合,從而導(dǎo)致Smad2的泛素化降解增加[2],因此我們認(rèn)為上調(diào)SARA可能減少了Smad2的泛素化降解,而使其蛋白表達(dá)水平升高,從而維持Smad2和Smad3表達(dá)水平的相對平衡,進(jìn)而抑制了HK-2細(xì)胞ECM的分泌。敲除SBD結(jié)構(gòu)域后,SARA不能與Smad2結(jié)合,因此對高糖介導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM分泌無影響。

小結(jié):我們認(rèn)為在高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ECM沉積過程中,SARA的表達(dá)下調(diào),可能通過降低Smad2的蛋白表達(dá),從而促進(jìn)TGF-β1信號通路的活化,導(dǎo)致HK-2細(xì)胞ECM沉積增加。過表達(dá)SARA可能上調(diào)Smad2的蛋白表達(dá),從而抑制TGF-β1信號通路傳導(dǎo),抑制HK-2細(xì)胞ECM分泌。SARA通過其SBD結(jié)構(gòu)域與Smad2結(jié)合,發(fā)揮以上的調(diào)節(jié)作用。目前并不清楚高糖通過何種機(jī)制介導(dǎo)SARA的表達(dá)下調(diào),可能SARA的啟動子序列中存在高糖及高糖相關(guān)的細(xì)胞因子的調(diào)控位點(diǎn),也可能存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控,具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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