祁建國

摘要：從植物組織培養(yǎng)中常見的污染、褐化、玻璃化現(xiàn)象等問題入手，分析了其形成的原因，并結(jié)合自身工作經(jīng)驗(yàn)提出針對(duì)性的解決策略，對(duì)植物的組織快繁和工廠化育苗具有一定的參考意義和借鑒價(jià)值。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；污染；褐化；黃化

1 污染問題及對(duì)策

1.1 污染原因分析

控制污染是組培過程中的首要技術(shù)。造成污染的原因很多，如外植體的種類、取材的季節(jié)、時(shí)間、預(yù)處理方法、消毒藥劑的種類、濃度、消毒時(shí)間以及消毒方法、培養(yǎng)基和器皿滅菌、操作人員、工作環(huán)境的要求、超凈工作臺(tái)的工作質(zhì)量等都與污染密切相關(guān)。一般來說，組培污染源分為3大類：材料帶菌、接種污染、培養(yǎng)過程感染。

1.2 對(duì)策

選擇合理的外植體種類、取材的季節(jié)、時(shí)間、初代接種選取大小適宜的外植體。在組培中應(yīng)選取帶菌較少或不帶菌體的材料作為外植體。對(duì)母株預(yù)處理，改善植株栽培環(huán)境，對(duì)母株噴布?xì)⒕鷦┗蚩股?。改變滅菌方法，使用真空減壓滅菌、多次消毒滅菌、混合消毒液、灼燒等。在培養(yǎng)基中加入其它抑菌劑。切分潛在的帶菌材料時(shí)，要保證所用的接種工具已經(jīng)過徹底的消毒；繼代培養(yǎng)時(shí)確保污染的材料應(yīng)給予丟棄。針對(duì)接種污染，要做到紫外燈接種室消毒，清洗超凈工作臺(tái)；接種工具、材料不要與酒精燈、超凈工作臺(tái)鐵網(wǎng)面、臺(tái)面接觸；接種人員接種時(shí)用酒精棉擦手或用濃度為75 %的酒精噴灑雙手，接種時(shí)應(yīng)穿上無菌的白大衣，戴上帽子和口罩；無菌室要注重平時(shí)除濕和熏蒸消毒工作。培養(yǎng)過程中要定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行消毒處理，及時(shí)清除污染材料，污染的材料及儀器必須經(jīng)過藥液消毒后方可使用。

2 褐化問題及控制措施

2.1 褐化概念及原因分析

褐化是指在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在誘導(dǎo)脫分化或再分化時(shí)，自身組織由其表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化一般分為2種：由于細(xì)胞受脅迫或其它不利條件影響所造成的細(xì)胞死亡而形成的褐化現(xiàn)象；由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影響褐化的因素一般與基因型、外植體情況、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基有關(guān)。如溫度對(duì)褐化影響很大，高溫能使 多酚氧化酶的活性提高，促進(jìn)酚類氧化；而低溫可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。

2.2 控制措施

多選擇幼齡植株取材，使外植體處于旺盛的生長狀態(tài)，可大大減輕褐變。在植株的一定部位取材，使材料中酚類物質(zhì)含量較低，也有助于減少褐化。對(duì)母株進(jìn)行遮光處理，不僅利于初代培養(yǎng)物的萌發(fā)，還可減輕褐化程度。利用硫代硫酸鈉、植酸、抗壞血酸等抗氧化劑、活性炭等吸附劑能夠阻止多酚氧化物對(duì)酚類物質(zhì)的氧化作用，可減少或減輕褐變。實(shí)驗(yàn)證明，瓊脂量的減少、較低的pH值也有利于減少褐變。選取適宜的培養(yǎng)條件如適度的低溫、初培暗光或弱光培養(yǎng)可抑制酚類的氧化，采用45℃以上的短時(shí)間高溫處理也能使多酚氧化酶失去活性，達(dá)到抗褐變的目的。

3 玻璃化現(xiàn)象及解決途徑

3.1“玻璃化現(xiàn)象”內(nèi)涵及發(fā)生原因

玻璃化現(xiàn)象是指在培養(yǎng)過程中材料呈半透明狀，組織結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形的現(xiàn)象。玻璃化的苗因組織畸形，分化能力降低，移栽后也很難成活，所以不宜用作繼代和移栽的材料。它已成為組培工作的一大難題，目前其根本原因尚無定論。根據(jù)吳若菁等[1]對(duì)香石竹的組培研究得知，影響組培苗玻璃化的原因主要與激素的種類、濃度、瓊脂的濃度、外植體的取材部位、不適宜的培養(yǎng)條件有關(guān)。

3.2 解決途徑

可從以下幾個(gè)方面降低或防止玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。①利用固體培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH值，提高瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量或加入滲透劑，提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低 NH4+濃度，降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分；③降低培養(yǎng)器內(nèi)部環(huán)境的相對(duì)濕度，保持適宜溫度，改善氧氣供應(yīng)狀況，減少玻璃化苗的出現(xiàn)；④適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度；⑤利用高于40℃的溫度對(duì)外植體熱擊處理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，實(shí)驗(yàn)證明，玻璃苗放于自然光下幾天后，莖、葉變紅，玻璃化現(xiàn)象可逐漸消失，這可能與自然光中的紫外線有關(guān)；⑦改善培養(yǎng)容器的通風(fēng)換氣條件，如用通氣好的封口膜封口。

4其它問題及相關(guān)對(duì)策

如黃化現(xiàn)象和變異率高的問題。培養(yǎng)基中 Fe含量不足、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良、培養(yǎng)溫度不適、激素配比不當(dāng)、糖用量不足、光照不足等都會(huì)造成黃化現(xiàn)象。只有找出問題的根源對(duì)癥下藥才能從根本上解決問題。關(guān)于變異率高的問題，不僅不利于保存資源和培育優(yōu)良的品種，還會(huì)嚴(yán)重影響工業(yè)化生產(chǎn)的組培苗的質(zhì)量，必須從原始材料、培養(yǎng)基配方、增殖代數(shù)、愈傷組織等方面嚴(yán)控變異率的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)

1 吳若菁,尤華明,彭東輝. 香石竹組培苗玻璃化控制的研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào),1995（4）

(責(zé)任編輯王蔓)