陜西省結核病防治院 （西安710100） 梁亞萍 劉尚武 高 漫

耐藥結核病產(chǎn)生的重要原因之一是不規(guī)范的抗結核治療，使結核分枝桿菌感染難以控制?？菇Y核藥物特別是二線抗結核藥物的規(guī)范化使用，對耐藥結核病的防治具有十分重要的意義。早期、準確、快速的抗結核藥物敏感性檢測試驗可以為臨床的規(guī)范化治療提供可靠依據(jù)。但是，傳統(tǒng)的二線藥物藥敏實驗檢測方法需時較長，遠不能滿足臨床診治的需求，因此有必要建立新的結核分枝桿菌快速藥敏檢測技術。美國BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT 960主要用于結核桿菌的快速診斷和一線藥物的藥敏檢測，目前，國外一些研究人員已經(jīng)開始將其用于二線藥物藥敏檢測［1，2］。本研究利用BACTEC MGIT 960進行96例結核菌株二線藥物藥敏檢測，并與傳統(tǒng)的L－J比例法進行對比，探討其在二線藥物藥敏試驗中的應用價值。

材料與方法

1 標本來源 本研究的96例菌株是2009年12月至2010年6月收集本院肺結核住院患者痰標本做快速培養(yǎng)，陽性菌株在完成一線藥物的敏感性試驗后，選取耐藥菌株（不論何種耐藥）行二線藥物的藥物敏感性試驗，以H37RV（ATCC27294）作為陰性對照。

2 試 劑

2.1 藥物：4種二線藥物為卷曲霉素（CPM），氧氟沙星（OFLX），卡那霉素（KAN），乙硫異煙胺（ETH）均為Sigma產(chǎn)品。藥物使用時均按照廠家提供的純度和效價計算用量：ETH和OFLX按照1000 μg／mg計算用量，CPM 按照795μg／mg計算用量，KAN按照762μg／mg計算用量。CPM和KAN用無菌去離子水溶解，OFLX用0.1NNaOH溶解，ETH用乙二醇溶解，各藥物在培養(yǎng)基的終濃度，見表1。

表1 含藥培養(yǎng)基的終濃度

2.2 BACTEC MGIT 960用試劑：分枝桿菌生長指示管（MGIT），SIRE添加劑，生長添加劑均為BD公司產(chǎn)品。

2.3 L－J方法用試劑：L－J法所用對照和含藥培養(yǎng)基均為改良羅氏培養(yǎng)基，其為貝索公司產(chǎn)品。

3 藥敏試驗 96株結核分枝桿菌臨床分離菌株分別用MGIT 960法（以下稱960法）和L－J比例法（以下稱L－J法）測試其藥物敏感性。

3.1 接種與孵育：①960法：二線藥物藥敏試驗方法與SIRE近似：每株結核桿菌需準備5支MGIT960培養(yǎng)管（1管為生長對照管，4管為加藥管），每管均加入0.8ml SIRE添加劑，4支加藥管各加入100ul CPM，KAN，OFLX，ETH，藥物終濃度見表1。然后，每支加藥管加入0.5ml菌懸液（報陽當天為第0d，報陽第1～2d的標本直接加原液，3～5d的標本需用1／5無菌生理鹽水稀釋），生長對照管（GCT）加l／100無菌生理鹽水稀釋的菌懸液0.5ml。將準備好的MGIT管按GCT，CPM ，OFLX，KAN，ETH的順序放入AST試管架，系統(tǒng)掃描試管架條形碼，按照儀器指示位置放入BACTEC MGIT 960儀器。②L－J法從報陽第4～5d的MGIT管（報陽后需置于37℃培養(yǎng)箱）底部吸取適量菌液于無菌研磨器中研磨，以0.5%吐溫－80生理鹽水配成1個麥氏比濁濃度，并用生理鹽水稀釋至10－2mg／ml和10－4mg／ml的菌懸液，取稀釋好的菌懸液分別接種于對照和含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。

3.2 結果判定：①960法 MGIT 960儀器會在4～13d內(nèi)，根據(jù)Growth Unit值，自動報告耐藥與敏感結果，但所出報告的藥物順序為CPM，OFLX，KAN，ETH。②L－J法：根據(jù)耐藥百分比判別：耐藥百分比＝（含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)／對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)）×100%，若耐藥百分比＞1%為耐藥（R），≤1%為敏感（S）。

4 質(zhì)量控制 每批試驗均應做質(zhì)控，質(zhì)控菌株為結核分枝桿菌標準株H37Rv。菌株對所有的抗結核藥物均敏感。

5 統(tǒng)計學方法 MGIT 960法和L－J法藥敏試驗測定結果的比較采用χ2檢驗，測定時間的比較采用t檢驗，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 960法與比例法藥敏結果比較：應用960法與L－J法檢測96株結核桿菌臨床分離菌株的CPM、OFLX、KAN和ETH的藥敏結果，見表2。兩法檢測CPM藥敏結果相符94株，不符2株；檢測OFLX藥敏結果相符96株，不符2株；檢測KAN藥敏結果相符86株，不符10株；檢測ETH藥敏結果相符82株，不符14株，符合率別是97.9%、97.9%、89.6%、85.4%。

表2 960法與L－J法檢測二線藥物的藥敏結果

2 960法與比例法的檢測時間：960法進行二線藥物藥敏試驗所需的時間平均9.1d，較L－J法32.5d早23.4d，二者的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表3。

表3 藥敏試驗測定所需時間（d）

討 論

近年來，全球耐藥結核病的發(fā)病率呈上升態(tài)勢［3］，已嚴重威脅人類的身體健康。耐藥結核病主要是由于濫用抗生素和不規(guī)范治療引起，因此，合理的臨床治療對于控制耐藥結核病極為關鍵?？焖佟蚀_的藥敏檢測不僅是臨床選擇和評價化療方案的有效依據(jù)，還是重要的流行病學指標，有助于我們掌握耐藥結核桿菌的分布和流行趨勢，對于控制耐壓結核病的流行和傳播至關重要。

二線抗結核藥是治療耐藥結核病的主要藥物，但目前，國內(nèi)常用的二線藥物藥敏試驗—L－J比例法耗時較長，遠不能滿足臨床早期診斷和治療的需求，因此，迫切需要開展新的快速、準確二線抗結核藥耐藥性檢測技術，以指導臨床合理用藥，這對控制耐藥結核病的流行和傳播至關重要。

MGIT 960是美國BD公司在BACTAC 460基礎上不斷改進和完善的新一代熒光檢測系統(tǒng)，一套分枝桿菌自動快速培養(yǎng)及藥敏系統(tǒng)，已獲得美國FDA的認證。盡管沒有專門的二線藥物試劑盒，但其用于二線藥物的敏感性診斷也被 WHO認可［3］，我們研究結果也顯示：960法的CPM、OFLX、KAN、和ETH的藥敏試驗結果與L－J比例法有較高的符合率，分別為97.9%，97.9%，86.9%和85.4%。

在檢測時間方面，MGIT960法具有很大的優(yōu)勢，平均9.1d就能發(fā)出藥敏報告，比L－J比例法縮短了23.4d。

MGIT 960法不足之處是需要昂貴的儀器設備，且檢測費用較高。

綜上所述，MGIT 960所得的二線藥物藥敏結果與傳統(tǒng)比例法有較好的一致性，所需的檢測時間較短，若患者經(jīng)濟條件允許，建議選擇MGIT 960方法進行二線藥物藥敏試驗，以便能更快速、準確地提供耐藥報告。

［1］ Kruuner A，Yates M D，Drobniewski F A.Evaluation of MGIT 960－based antimicrobial testing and determination of critical concentrations of first－and second－line antimicrobial drugs with drug－resistant clinical strains of M.tuberculosis［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：811－818.

［2］ Rüsch－Gerdes S，Pfyffer G E，Casal M，etal.Multicenter laboratory validation of drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis against classical secondline drugs and newer antimicrobials by Bactec MGIT 960 Technique［J］.J Clin Microbiol，2006，44（3）：688－692.

［3］ Aziz M A，Wright A，Laszlo A，etal.Epidemiology of antituberculosis drug resistance（the Global Project on Anti－Tuberculosis Drug Resistance Surveillance）：an updated analysis ［J］.Lancet，2006，368（9553）：2142－2154.