齊興峰 謝飛來(lái) 朱育連 鄭智勇

（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福建 350025）

目前病理學(xué)診斷麻風(fēng)病主要依靠HE染色形態(tài)特點(diǎn)和抗酸染色找到麻風(fēng)桿菌作為確診依據(jù)［1］?？顾崛旧ㄗ鳛榻?jīng)典的麻風(fēng)桿菌檢測(cè)方法，一直以來(lái)都被各級(jí)醫(yī)院應(yīng)用。瘤型麻風(fēng)病變中麻風(fēng)桿菌很容易被抗酸染色顯示，但在結(jié)核型或未定型麻風(fēng)病變中桿菌數(shù)量非常少，可能會(huì)出現(xiàn)陰性染色；或僅有極少量桿菌，需要鏡檢者花較長(zhǎng)時(shí)間仔細(xì)尋找才能查到一根抗酸桿菌［2］。采用PCR檢測(cè)麻風(fēng)桿菌是目前比較先進(jìn)的方法，但由于麻風(fēng)病例數(shù)量少，一般醫(yī)院都沒(méi)有備有相應(yīng)的檢測(cè)試劑。

金胺O熒光染色原理與抗酸染色相似，臨床上主要用于痰液或分泌物中結(jié)核桿菌的檢測(cè)［3］。我們?cè)C實(shí)金胺O熒光染色可以用于石蠟切片檢測(cè)結(jié)核桿菌以及非結(jié)核分支桿菌［4］，且效果優(yōu)于抗酸染色。本文將進(jìn)一步觀察金胺O熒光法用于石蠟切片中麻風(fēng)桿菌的染色效果。

材料和方法

1 標(biāo)本

選取我科存檔的麻風(fēng)病組織蠟塊6例，其中瘤型麻風(fēng)5例，未定型麻風(fēng)1例；男性4例，女性2例，年齡34歲－72歲，中位年齡53歲。另取異物性肉芽腫6例作為陰性對(duì)照。每例組織連續(xù)石蠟切片4μm厚，分別做金胺O熒光染色和抗酸染色。

2 金胺O熒光染色

染色劑：金胺O粉劑0.1g溶于10ml 95%乙醇中，加5%石碳酸至100ml；脫色劑：3%鹽酸－75%乙醇；復(fù)染劑：0.5%高錳酸鉀水溶液。步驟：切片脫蠟至水，浸入預(yù)熱的染色劑中63℃染色15－25min，水洗，脫色劑脫色2－5min至無(wú)黃色，水洗，復(fù)染劑復(fù)染30s－2min，水洗，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；熒光鏡檢。

3 抗酸染色

染色劑：堿性復(fù)紅8g溶于95%乙醇10ml中，加5%石碳酸900ml，放置24h后過(guò)濾備用；脫色劑：5%鹽酸－75%乙醇；復(fù)染劑：0.15g溶入50ml 95%乙醇中，加蒸餾水至1000ml。步驟：切片脫蠟至水，浸入預(yù)熱的染色劑中63℃染色25－35min，水洗，脫色劑脫色2－5min至無(wú)紅色，水洗，復(fù)染劑復(fù)染1－3min，水洗，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片；光鏡鏡檢。

4 陽(yáng)性定量

400 倍視野巡視整個(gè)組織切面，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為陰性；發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)桿菌后，在桿菌陽(yáng)性處看5個(gè)視野：＜10條抗酸桿菌/視野為弱陽(yáng)性（＋）；＞10～100條/視野為中陽(yáng)性（＋＋）；＞100條/視野為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

結(jié) 果

6例麻風(fēng)病組織蠟塊金胺O熒光染色和抗酸染色均顯示麻風(fēng)桿菌陽(yáng)性（附表）。例3瘤型麻風(fēng)金胺O染色除了皮膚真皮肉芽腫組織中有大量麻風(fēng)桿菌外，在表皮內(nèi)也可以見(jiàn)到少量單根散在的麻風(fēng)桿菌；連續(xù)切片的抗酸染色片皮膚真皮肉芽腫組織中有大量麻風(fēng)桿菌，但未能見(jiàn)到表皮層內(nèi)單根散在麻風(fēng)桿菌（圖1，2）；例6未定型麻風(fēng)肉芽腫組織中僅有少量單根散在的麻風(fēng)桿菌。金胺O熒光染色片在熒光鏡下麻風(fēng)桿菌呈明亮淡綠色細(xì)長(zhǎng)桿狀、略為彎曲的發(fā)光體，因背景暗色對(duì)比清晰（圖3）；抗酸染色片麻風(fēng)桿菌呈紅色細(xì)桿狀，背景對(duì)比不如金胺O染色清晰（圖4）。6例異物肉芽腫金胺O熒光染色和抗酸染色均為陰性。

表1 金胺O熒光和抗酸染色結(jié)果Table1 The results of acid－fast stain and auramine O fluorescent stain

圖1 金胺O染色片顯示表皮內(nèi)單根散在的麻風(fēng)桿菌，真皮淺層散在一些麻風(fēng)桿菌（×400）；Fig 1.Auramine O fluorescent stain showed scattered M.Leprae in the epidermis layer and the upper dermis（×400）；

圖2 與圖1同一部位連續(xù)切片的抗酸染色片，表皮內(nèi)未見(jiàn)單根散在的麻風(fēng)桿菌，真皮淺層散在一些麻風(fēng)桿菌（×400）；Fig 2.Acid－fast stain of serial section on the same site of the case in the figure 1，was not observed in the epidermis layer，but some scattered M.Leprae was in the upper dermis（×400）；

圖3 金胺O染色片熒光鏡暗背景下顯示大量麻風(fēng)桿菌團(tuán)，不易分辨菌體結(jié)構(gòu)，但其間散在的單根麻風(fēng)桿菌形態(tài)清晰，呈細(xì)桿狀，輕度彎曲（×1000）；Fig 3.Auramine O fluorescent stained section under the darkfiled of fluoroscope showed a large number of M.leprae，and it was difficult to distinguish the structure of of the bacteria，however，the structure of the scattered M.Leprae can be seen clearly，which is thin rod，and bend slightly（×1000）；

圖4.與圖3同一部位連續(xù)切片的抗酸染色片，顯示大量麻風(fēng)桿菌團(tuán)和單根散在的麻風(fēng)桿菌（×1000）。Fig 4.Acid－fast stain of serial section on the same site of the case in the figure 3，showed a large number of M.leprae colony and scattered M.Leprae（×1000）.

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界都將抗酸染色作為顯示麻風(fēng)桿菌的法定檢測(cè)方法。然而這一做法有一定局限性，主要是在麻風(fēng)桿菌稀少的結(jié)核型或未定型麻風(fēng)病組織中，采用抗酸染色有時(shí)候會(huì)得到陰性結(jié)果，有時(shí)需要付出長(zhǎng)時(shí)間耐心的鏡檢觀察才能發(fā)現(xiàn)極少量的麻風(fēng)桿菌［2，5］。這些情況都有可能導(dǎo)致麻風(fēng)病的漏診。

金胺O熒光染色法和抗酸染色的原理相同，都是利用了抗酸桿菌菌壁脂質(zhì)的嗜酸性，在染色劑中加入了石炭酸作為媒染劑，來(lái)顯示麻風(fēng)桿菌。國(guó)外已有將金胺O染色用于麻風(fēng)桿菌的組織切片和組織液涂片檢查的報(bào)道［6，7］，但國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)這方面的報(bào)道。我們?cè)谖墨I(xiàn)中報(bào)道金胺O染色可以代替抗酸染色用于顯示結(jié)核桿菌和非結(jié)核性分支桿菌，其優(yōu)點(diǎn)是陽(yáng)性率明顯高于抗酸染色［4］。

本文采用金胺O熒光染色對(duì)6例麻風(fēng)病石蠟組織切片進(jìn)行染色，并與抗酸染色結(jié)果相比較。結(jié)果顯示，兩種方法均可以顯示麻風(fēng)桿菌。由于病例數(shù)量受限，不能對(duì)這兩種方法在陽(yáng)性率方面進(jìn)行比較。對(duì)比鏡檢效果，熒光鏡檢由于背景為暗視野，亮綠色熒光的麻風(fēng)桿菌在鏡下十分清晰，400倍視野下即可輕易找到散在的單根麻風(fēng)桿菌；抗酸染色片在光鏡下觀察，少量單根的麻風(fēng)桿菌需要在油鏡下（1000倍視野）仔細(xì)尋找方能找到。在觀察有大量麻風(fēng)桿菌的標(biāo)本時(shí)，熒光鏡檢并不占優(yōu)勢(shì)；但觀察極少量麻風(fēng)桿菌的標(biāo)本時(shí)，熒光鏡檢具有找菌時(shí)間短，不易視覺(jué)疲勞等優(yōu)點(diǎn)。

例3瘤型麻風(fēng)的金胺O染色片除了在肉芽腫組織中見(jiàn)到大量麻風(fēng)桿菌外，皮膚表皮棘層內(nèi)及角化層下也可以看到少量單根麻風(fēng)桿菌，連續(xù)切片的抗酸染色片中未見(jiàn)此現(xiàn)象；三次重復(fù)染色均為此結(jié)果，提示金胺O染色顯示少量單根散在的麻風(fēng)桿菌的效果優(yōu)于抗酸染色。少數(shù)瘤型麻風(fēng)表皮內(nèi)有少量麻風(fēng)桿菌這一現(xiàn)象印度學(xué)者和日本學(xué)者均有過(guò)報(bào)道［8，9］。這一現(xiàn)象提示少數(shù)瘤型麻風(fēng)患者可以通過(guò)無(wú)破損的皮膚排出麻風(fēng)桿菌，這對(duì)了解麻風(fēng)桿菌的傳染途徑有一定意義。

需要注意的是，金胺O熒光染色存在一定的假陽(yáng)性。這是由于在切片、染色等過(guò)程中污染的雜質(zhì)經(jīng)過(guò)金胺O熒光染色后會(huì)發(fā)出與麻風(fēng)桿菌相同的淡綠色熒光，鏡檢醫(yī)生容易把淡綠色熒光的雜質(zhì)當(dāng)成麻風(fēng)桿菌。為了避免假陽(yáng)性，在400倍視野下發(fā)現(xiàn)疑似麻風(fēng)桿菌后，應(yīng)轉(zhuǎn)到1000倍視野下進(jìn)一步辨認(rèn)確定。

總之，本文證實(shí)金胺O熒光染色法可以應(yīng)用于石蠟組織切片麻風(fēng)桿菌的檢測(cè)，而且對(duì)于顯示少量單根散在的麻風(fēng)桿菌效果優(yōu)于抗酸染色。兩種方法聯(lián)合應(yīng)用可以提高麻風(fēng)病理診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。

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