趙冬梅 韓 芳 石玉秀

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理研究所，組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室；沈陽 110001）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post traumatic stress disorder，PTSD）是以反復(fù)的創(chuàng)傷性體驗(yàn)重現(xiàn)，記憶異常，情緒障礙，警覺性高并伴有持續(xù)性回避癥狀為特征的臨床綜合征，患者往往有各種災(zāi)難性突發(fā)事件的經(jīng)歷，如海嘯、地震、洪水、戰(zhàn)爭(zhēng)等。近幾年由于突發(fā)自然災(zāi)害的頻發(fā)，PTSD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。有調(diào)查資料顯示［1］汶川地震過后，2250名青少年中患有PTSD癥狀者達(dá)15.8%之多。PTSD患者往往會(huì)出現(xiàn)記憶的障礙，精神障礙或焦慮綜合征，或者是患者反復(fù)的回憶起恐怖的場(chǎng)景，由此導(dǎo)致身心異常痛苦，但目前尚缺乏有效的治療手段，因此揭示其發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose－regulated protein 94，GRP 94）是一種高度保守的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，在正常細(xì)胞中GRP94具有協(xié)助新合成蛋白，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾、抑制錯(cuò)誤折疊蛋白分泌的作用。細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋超載，缺氧等條件下都可發(fā)生非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein reaction，UPR），是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)。關(guān)于PTSD是否出現(xiàn)UPR，其發(fā)生過程中的作用機(jī)制及意義的研究目前未見報(bào)道，為探討GRP94及非折疊蛋白反應(yīng)在PTSD發(fā)病中的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬利用PTSD－SPS模型，采用免疫組化、蛋白免疫印跡和RT－PCR方法，檢測(cè)PTSD大鼠mPFC神經(jīng)元GRP94表達(dá)變化。旨在探討PTSD有否激活UPR，為進(jìn)一步揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制尋找新藥靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

60只健康成年 Wistar大鼠，雄性，體重250－300g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，GRP 94一抗購于Santa Cruz公司。引物自行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2.動(dòng)物分組及造模

60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、連續(xù)單一刺激SPS實(shí)驗(yàn)組（SPS－1d，SPS－4d，SPS－4d，SPS－7d）各15只，造模方法采用2005年日本文部省召開的國際PTSD科學(xué)會(huì)議確定的方法［2－3］，將大鼠禁錮2h，立即強(qiáng)迫游泳20min［水深40cm，水溫（24±1）℃］，恢復(fù)15min，乙謎麻醉至大鼠意識(shí)喪失，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。正常對(duì)照組不做任何處理。SPS造模后1d，4d，7d各時(shí)間點(diǎn)取材，供分別進(jìn)行的免疫組織化學(xué)、蛋白印跡、逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）使用。

3.GRP94的免疫組織化學(xué)檢測(cè)

相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材，標(biāo)本經(jīng)5%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。采用SAB法，操作按SAB試劑盒說明書進(jìn)行，具體操作步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3﹪和H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，置入0.01 mol/L（pH 6.0）檸檬酸鹽緩沖液中高壓抗原修復(fù)，室溫下冷卻15－20min，5%BSA封閉，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。一抗GRP94以1∶500 4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加50μl生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30min，PBS沖洗3次，滴加50μl新鮮配制的DAB溶液，顯色10min；蘇木精復(fù)染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

4.Western Blot檢測(cè)GRP94的表達(dá)

取新鮮標(biāo)本100mg，加入0.5ml RIPA裂解液，超聲粉碎儀粉碎2s5次，4℃，12000rp離心，提取上清，運(yùn)用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，5﹪濃縮膠和10﹪分離膠電泳，每孔上樣量含蛋白30μg。電泳完畢后恒壓45v轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃ 搖床封閉2h，加入兔抗鼠GRP94多克隆抗體（1∶500稀釋）4℃ 過夜。TBST洗膜5min×5次，加入 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1：5000稀釋）37℃ 搖床反應(yīng)2h，TBST洗膜洗膜5min×5次，加入ECL發(fā)光顯影?；叶戎捣治?。

5.RT－PCR檢測(cè)GRP94mRNA表達(dá)

造模后，于各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材100mg，加入1mlTrizol，顛倒混勻靜置5min；加0.2ml氯仿，顛倒混勻，靜置5min，12000rmp離心15min，0.5ml異丙醇－20℃中1h，提出 RNA，溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的雙蒸水中。測(cè)得樣品總RNA濃度，－80℃保存。按試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，內(nèi)參和引物序列見（表1）。GRP94擴(kuò)增條件均為：94℃2min；94℃30s；52℃60s；72℃2s；30個(gè)循環(huán)，72℃8min。擴(kuò)增結(jié)束后取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi).5%瓊脂糖凝膠電泳，天能GIs凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照并進(jìn)行平均光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照β－actin的平均吸光度的比值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

表1 GRP94和內(nèi)參引物序列Table1 primers for GRP94，β－actin

6.圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組隨機(jī)抽取光免疫組織化學(xué)染色切片8張，每張5個(gè)視野，利用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度的平均光密度值。將所得析數(shù)據(jù)結(jié)果均應(yīng)用SPSS13.0軟件包處理，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)mPFC部位GRP94的表達(dá)

GRP94免疫組化反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，定位于胞漿，可見皮質(zhì)大錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿棕黃色的陽性反應(yīng)顆粒。正常組可見少量陽性細(xì)胞，SPS造模后陽性細(xì)胞逐漸增多，至7d組表達(dá)達(dá)到最高（圖1）。Image－pro plus6.0軟件平均光密度分析，分析結(jié)果見（表2）。

圖1 mPFC部位各組GRP94免疫組織化學(xué)表達(dá)A：正常對(duì)照組；B：SPS－1d；C：SPS－4d；D：SPS－7dall×400Fig.1 Immunohistochemistry of GRP94in mPFC of PTSD ratsA：control group；B：SPS－1d；C：SPS－4d；D：SPS－7dall×400

2.westem blotting分析mPFC部位的GRP94

蛋白印跡法檢測(cè)mPFC部位的GRP94的表達(dá)，以 GAPDH（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase）的吸光度值作為內(nèi)參照，對(duì)各組條帶的吸光度值進(jìn)行校正和半定量分析。與正常對(duì)照組相比，SPS模型組mPFC部位的GRP94蛋白水平變化明顯：SPS刺激后1d后表達(dá)開始逐漸增加，至7d表達(dá)最高 （圖2），分析結(jié)果見（表2）。

圖2 mPFC部位各組GRP94表達(dá)（westem blotting），由左至右依次為正常對(duì)照組及SPS－1d、SPS－4d、SPS－7dFig.2 The GRP94mPFC expression in each group（westem blotting），F(xiàn)rom left to right，control group，SPS－ld，SPS－4d，SPS－7d

3.RT－PCR分析mPFC部位的GRP94mRNA表達(dá)

RT－PCR結(jié)果 （圖3）顯示，在正常組大鼠mPFC部位GRP94mRNA有少量表達(dá)，SPS刺激后，GRP94mRNA的表達(dá)出現(xiàn)逐漸上調(diào)的趨勢(shì) （P＜0.05），至7d最高，與westem blotting結(jié)果隨時(shí)間變化一致。分析結(jié)果見（表2）。

圖3 mPFC部位各組GRP94mRNA表達(dá)，由左至右依次為正常對(duì)照組及SPS－1d、SPS－4d、SPS－7dFig.3 The GRP94mRNA expression in each group.From left to right，control group，SPS－ld，SPS－4d，SPS－7d

表2 mPFC部位GRP94免疫組織化學(xué)平均光密度（OD），westem blotting，RT－PCR平均灰度值（±s）Table2 GRP94in mPFC mean density，average gray value（westem blotting，RT－PCR）（±s）

表2 mPFC部位GRP94免疫組織化學(xué)平均光密度（OD），westem blotting，RT－PCR平均灰度值（±s）Table2 GRP94in mPFC mean density，average gray value（westem blotting，RT－PCR）（±s）

＊與對(duì)照組比較，P＜0.05；＊＊與對(duì)照組比較，P＜0.01（＊compared with control group），P＜0.05；（＊＊compared with control group），P＜0.01

Mean density（OD）Immunohistochemistry Average gray value Westem blotting RT–PCR Control group 0.3160±0.0398 0.9110±0.0228 0.9137±0.0303 SPS－ld 0.3554±0.0327＊ 0.9685±0.0495＊ 1.40580.0400±＊SPS－4d 0.4040±0.0825＊ 0.9953±0.0520＊ 1.507±0.090＊SPS－7d 0.4772±0.0983＊＊ 1.0673±0.0333＊＊ 1.5770±0.0680＊＊

討 論

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post traumatic stress disorder）是指經(jīng)受了突發(fā)性的巨大災(zāi)難或異乎尋常威脅后產(chǎn)生的長期持續(xù)性的精神障礙或焦慮綜合征。PTSD患者可引起明顯的社會(huì)心理功能障礙，對(duì)家庭、社會(huì)和身心健康造成長期的影響?，F(xiàn)有的研究證明PTSD患者有海馬、杏仁核、藍(lán)斑以及額葉皮質(zhì)等的影像學(xué)及形態(tài)學(xué)異常改變［4－5］。mPFC是大腦功能的執(zhí)行中樞，與大腦其他部位聯(lián)系密切，參與情緒中樞環(huán)路的組成，是情緒中樞通路的重要環(huán)節(jié)之一。mPFC的外傷性損傷可導(dǎo)致患者出現(xiàn)情緒和社會(huì)性行為異常［6］，出現(xiàn)無法消退的恐懼性條件反射，而這些可能都和患者的闖入性記憶有關(guān)［7］。有研究表明［8－9］PTSD大鼠 mPFC糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體在下丘腦一垂體一腎上腺軸（HPA）的調(diào)節(jié)中有時(shí)間性的改變，提示mPFC也是HPA軸負(fù)反饋抑制部位，和海馬、杏仁核、藍(lán)斑等同是PTSD患者發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)中起到重要作用的關(guān)鍵腦區(qū)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白－分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose－regulated protein，GRP）GRP78和 GRP94是分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的應(yīng)激蛋白，出現(xiàn)在不同時(shí)期發(fā)育中的小鼠腦組織中［10］，具有促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白正確折疊、修飾、保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的作用。正常情況下GRP94即少量表達(dá)，其分布和表達(dá)均受細(xì)胞周期的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)中正常對(duì)照組免疫組化切片可見少量GRP94陽性細(xì)胞，western－blotting實(shí)驗(yàn)也提示正常組GRP94蛋白弱表達(dá)。真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）負(fù)責(zé)分泌性蛋白的折疊和組裝，其對(duì)內(nèi)外環(huán)境的變化極為敏感，當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外源刺激時(shí)，ER中未經(jīng)折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白增多，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，應(yīng)急信號(hào)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳遞至細(xì)胞核，引起以GRP94在內(nèi)的一系列特定的分子伴侶（Chaperon）的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，與未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白分子結(jié)合使之正確折疊，細(xì)胞發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)（unfoldedprotein response，UPR）。UPR啟動(dòng)以后將非折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜傳入胞漿降解，以減少在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積和聚集。

PTSD－SPS刺激作為一種應(yīng)激源可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，GRP 94位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。我們的前期研究闡明PTSD－SPS模型大鼠鈣平衡紊亂［11］，加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)可使GRP 94大量表達(dá)，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，使蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下繼續(xù)正確合成，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。SPS刺激造模后，模型組大鼠GRP94蛋白表達(dá)增高同時(shí)伴有GRP94mRNA表達(dá)逐漸增高，至第7天大鼠的mPFC部位GRP94mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均到最強(qiáng)，無論從分子水平或蛋白水平變化趨勢(shì)相符，提示了GRP94的表達(dá)調(diào)控是發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄水平。

GRP94還具有維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的作用，可能起到對(duì)細(xì)胞一定程度的保護(hù)作用。若長期過強(qiáng)的應(yīng)激或是長時(shí)間的過度的UPR，超出GRP94處理能力，過多的非折疊蛋白沉積，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)功能障礙，細(xì)胞將啟動(dòng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路凋亡機(jī)制：激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡因子。隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)間延長，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)無法恢復(fù)，最終未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞以凋亡形式死亡，保護(hù)機(jī)體組織免于應(yīng)激帶來的損傷［12－13］。也有學(xué)者認(rèn)為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白積聚時(shí)，GRP94可從正常狀態(tài)下與跨膜蛋白IRE1、ATF6和PERK的結(jié)合狀態(tài)分離，而應(yīng)付未折疊蛋白，并啟動(dòng)三條通路，從而介導(dǎo)不同的下游反應(yīng)，即存在一個(gè)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控GRP94的自身表達(dá)，而GRP94的活性增加又可對(duì)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)起到降低和消除的作用［14］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SPS刺激后，大鼠mPFC神經(jīng)元分子伴侶GRP94表達(dá)發(fā)生變化，提示PTSD－SPS刺激可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活mPFC神經(jīng)元出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)，PTSD的發(fā)生過程中，GRP94參與了未折疊蛋白反應(yīng)，本研究對(duì)揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可從GRP94對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用來為臨床床尋找新藥靶點(diǎn)提供新思路。

［1］Fan F，Zhang Y，Yang Y，et al.Symptoms of posttraumatic stress disorder，depression，and anxiety among adolescents following the 2008Wenchuan earthquake in China.Trauma Stress，2011，24（1）：44－53

［2］Takahashi T，Morinobu S，Iwamoto Y，et al.Effect of paroxetine onenhanced contextual fear indu ced by single prolonged stress in rats.Psychopharmacology （Ber），2006，189（2）：165－173

［3］Kohda K，Harada K，Kato K，et al.Glucocorticoid receptor activationis involved in producing abnormal phenotypes of single－prolonged stress rats：aputative posttraumatic stress disorder model.Neuroscience，2007，148（1）：22－33

［4］Acheson DT，Gresack JE，Risbrough VB.Hippocampal dysfunction effects on context memory：Possible etiologyfor posttraumatic stress disorder.Neuropharmacology，2012，62（2）：674－685

［5］閆勝男，韓芳，石玉秀.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元整合素的表達(dá)變化.解剖科學(xué)進(jìn)展，2012，18（1）：22－24，29

［6］Damasio H，Grabowski T Frank R，et al.The return of Phineas Gage：clues about the brain from the skull of a famous patient.Science，1994，264（5162）：1102－1105

［7］高潔，劉良明，武亞民.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙闖入性記憶的生物學(xué)機(jī)制.現(xiàn)代生物學(xué)進(jìn)展，2009，9（23）：4564－4566

［8］張景華，李慢，石玉秀，等.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠前額葉內(nèi)側(cè)皮質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)增高.解剖學(xué)報(bào)，2011，42（2）：151－154

［9］張景華，李慢，石玉秀等.創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)MR表達(dá)的變化.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2011，20（1）：6－10

［10］李波，王大鵬，方文剛等.葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白Grp78和Grp94在小鼠腦發(fā)育過程中的差異性表達(dá).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2006，33（7）：641－646

［11］Yu Wen，Bin Li，F(xiàn)ang Han.et al.Dysfunction of calcium/calmodulin/CaM kinase IIαcascades in the medial prefrontal cortex in post－traumatic stress disorder.Molecular medicine reports，2012，6：1140－1144

［12］Dolai S，Pal S，Yadav RK，et al.Endoplasmic reticulum stress－induced apoptosis in Leishmania through Ca2＋－dependent and caspase－independent mechanism.J Biol Chem，2012，（109）：7469－7474

［13］Bernales，feroz R rapa，Peter walter.Intracellular signaling by the unfolded protein response.Annu Rev Cell Dev Biol，2006，22：487－508

［14］Patil C，Walter P.Intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the nucleus：the unfolded protein response in yeast，and mammals.Curr Opin Cell Biol，2001，13（3）：349－355