張 杰 王 赟 陳小希

（1十堰市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 湖北442000；2中國人民解放軍 95825部隊(duì)醫(yī)院 湖北 432111；3湖北省地質(zhì)職工醫(yī)院 武漢430072）

胰腺癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，早期診斷困難，并且對(duì)各種輔助治療敏感性不高［1］，生存率低，是預(yù)后差的惡性腫瘤之一［2］。胰腺癌發(fā)病率逐年上升，已成為胃腸道惡性腫瘤中繼結(jié)、直腸癌后第4位致患者死亡的原因。因此，對(duì)胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的研究，對(duì)于提高胰腺癌的診斷和治療有極其重要的意義。

包含 WW 域的氧化還原酶（WW domain－containing oxidoreductase，WWOX）基因是一個(gè)跨越了染色體脆性位點(diǎn)FRA16D的抑癌基因，內(nèi)、外源性多種因素造成FRA16D斷裂，使WWOX基因發(fā)生基因組重排而失活，導(dǎo)致WWOX基因在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低或缺失［3－4］。

本文通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)胰腺癌及胰腺炎組織中WWOX蛋白的表達(dá)水平，探討WWOX蛋白在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為臨床上治療胰腺癌提供理論依據(jù)。

材料和方法

1.材料來源

人胰腺癌芯片4張由桂林泛譜生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，15×10點(diǎn)陣，每點(diǎn)直徑1.1mm，4μm厚，其中包括70例胰腺癌組織和5例胰腺炎，雙芯布陣。所有組織來自臨床外科手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)10%中性緩沖甲醛固定24h。

2.主要試劑

即用型鼠抗人WWOX單克隆抗體（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（購于福州邁新公司）；DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸（購于北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

3.方法

3.1 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色

3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)WWOX相關(guān)抗原 具體步驟：（1）4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，購買的陽性片作為WWOX的陽性對(duì)照組。

4.免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

（1）WWOX以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

（2）采用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)WWOX的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS11.5軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.WWOX的表達(dá)

胰腺癌胞質(zhì)內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，WWOX表達(dá)弱（圖1）；胰腺炎胞質(zhì)內(nèi)可見較多的棕黃色顆粒，WWOX表達(dá)強(qiáng)（圖2）。

2.圖像分析結(jié)果顯示

胰腺癌組 WWOX的平均光密度為0.0854±0.0024，胰腺炎組 WWOX的平均光密度為0.2105±0.0083；胰腺癌組WWOX的陽性面積率為0.0862±0.0029，胰腺炎組WWOX的陽性面積率為0.2280±0.0079。胰腺癌組織中WWOX的表達(dá)明顯低于胰腺炎組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

圖1 WWOX的表達(dá) 胰腺癌腺泡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，WWOX表達(dá)弱，S－P×400Fig.1 The expression of WWOX There were few brown particles in the cytoplasm of pancreatic cancinoma acinar cell，which showed WWOX expressed weakly.S－P×400

圖2 WWOX的表達(dá) 胰腺炎腺泡細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見較多的棕黃色顆粒，WWOX表達(dá)強(qiáng)，S－P×400Fig.2 The expression of WWOX There were plenty of brown particles in the cytoplasm of pancreatitis acinar cell，which showed WWOX expressed strongly.S－P×400

表1 胰腺癌和胰腺炎組織中WWOX表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（±s）Table1 The average optical density and the rate of WWOX positive area in Pancreatic cancer and pancratitis（±s）

表1 胰腺癌和胰腺炎組織中WWOX表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（±s）Table1 The average optical density and the rate of WWOX positive area in Pancreatic cancer and pancratitis（±s）

（Comparison between Pancreatic cancer and pancreatitis）▲與胰腺炎組比較，P＜0.05

組別Groups例數(shù)N 平均光密度Average Optical Density 陽性面積率Rate of Positive胰腺癌Pancreatic cancer 70 0.0854±0.0024▲ 0.0862±0.0029▲胰腺炎pancreatitis 5 0.2105±0.0083 0.2280±0.0079

討 論

胰腺原發(fā)性腫瘤主要包括三種組織來源，即外分泌、內(nèi)分泌和間葉組織。胰腺外分泌部腫瘤占了胰腺腫瘤的90%以上，其中80%來源于胰腺導(dǎo)管上皮。胰腺癌的發(fā)病率近年來呈上升趨勢(shì)，2002年統(tǒng)計(jì)胰腺癌死亡率位于我國10種惡性腫瘤的第6位，美國位于第4位。由于胰腺解剖位置隱匿，早期癥狀不明顯，而且缺乏敏感性高的早期診斷標(biāo)志物，大部分患者就診時(shí)已為中晚期，失去了最佳的手術(shù)時(shí)機(jī)。胰腺癌同時(shí)具有高度惡性的生物學(xué)行為，臨床經(jīng)過兇險(xiǎn)生存率很低。

隨著科技進(jìn)步和醫(yī)學(xué)發(fā)展，人類戰(zhàn)勝了多種疾病的挑戰(zhàn)，但惡性腫瘤仍然嚴(yán)重威脅著人們的生命和健康。盡管目前的手術(shù)配合放化療的治療方式在一定程度上幫助一部分患者擺脫了腫瘤疾病的困擾，但惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍在逐年增高。因此，從根本上降低腫瘤的發(fā)生，延緩其發(fā)展速度，同時(shí)提高患者自身的抗腫瘤能力就成為一個(gè)丞待解決的問題。

惡性腫瘤屬于一種基因病，在其發(fā)生發(fā)展過程中涉及多種基因的改變，其中抑癌基因的缺失或失活發(fā)揮著重要作用。人為的引入或激活抑癌基因，是從根本上防治惡性腫瘤的基因療法，正成為一種極具前景的生物學(xué)治療手段受到各國的重視，并為此展開了廣泛研究。

包含 WW域的氧化還原酶（WW domain－containing oxidoreductase，WWOX）基因是2000年新發(fā)現(xiàn)的在普通型脆性位點(diǎn)FRA16D上的候選抑癌基因，跨越了基因組內(nèi)STS markers D16s518和D16s516的一個(gè)＞100萬bp的區(qū)域內(nèi)、外源性多種因素造成 FRA16D 斷裂［5－7］，使 WWOX 基因發(fā)生基因組重排而失活，導(dǎo)致WWOX基因在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低或缺失。某些腫瘤細(xì)胞因?yàn)閃WOX基因的缺乏而不能發(fā)生凋亡，穩(wěn)定表達(dá) WWOX基因的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性下降。這些發(fā)現(xiàn)提示W(wǎng)WOX基因能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，因此有人認(rèn)為 WWOX基因是一種抑癌基因［8－10］。盡管仍有人對(duì)這一結(jié)論提出質(zhì)疑，但是 WWOX的抗腫瘤作用已經(jīng)被多數(shù)學(xué)者認(rèn)同。揭示W(wǎng)WOX基因的抑癌機(jī)制、使其更好的發(fā)揮抑癌作用，對(duì)以 WWOX基因?yàn)榘悬c(diǎn)的腫瘤基因治療有更加現(xiàn)實(shí)的意義。

WWOX蛋白表達(dá)異常已在多種腫瘤上有發(fā)現(xiàn)［11－14］，而在胰腺癌中的表達(dá)國內(nèi)外少見報(bào)道，我們應(yīng)用免疫組化研究 WWOX在胰腺癌中的表達(dá)，并探討與其生物學(xué)行為及預(yù)后關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)WWOX基因在胰腺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：胰腺癌組織中WWOX蛋白呈低表達(dá)，胰腺炎組織中，WWOX蛋白呈高表達(dá)。在胰腺癌中WWOX蛋白的含量明顯低于胰腺炎組織 （P＜0.05），提示W(wǎng)WOX蛋白可能參與調(diào)控了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

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