陳婷婷 吳正升 王 弦 虞紅珍 孟 剛

（安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤的侵襲性生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其難以根治和導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。因此，理解乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移背后的分子機(jī)制，發(fā)掘有效的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，對(duì)判定患者的預(yù)后、及時(shí)治療，從而提高患者的療效和預(yù)后有著十分重要的意義。c－Met基因是編碼肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）受體蛋白的原癌基因，廣泛存在于包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種上皮細(xì)胞，其通過與HGF結(jié)合，而在腫瘤細(xì)胞的播散、侵襲、遷移及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。明膠酶（MMP－2，－9）是基質(zhì)金屬蛋白酶（metrix metalloproteinases，MMPs）家族重要成員，能夠特異性降解基底膜的主要成分IV型膠原和細(xì)胞外基質(zhì)，從而在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要的作用。目前，關(guān)于c－Met與明膠酶在人乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)系似未見報(bào)道，兩者之間是否相互作用尚不明朗。本研究首先利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)人乳腺癌組織c－Met的表達(dá)及其與明膠酶表達(dá)的相關(guān)性，然后通過體外實(shí)驗(yàn)和siRNA干擾技術(shù)，分析兩者之間的關(guān)系，力圖探討c－Met在人乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能的角色及其分子機(jī)制。

材料和方法

1.材料

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺癌病例86例乳腺癌組織。所有標(biāo)本均以4%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)做蘇木精－伊紅（HE）染色，組織病理學(xué)確診。所有病例以3μm厚度連續(xù)切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)先處理的載玻片上，備用。人乳腺癌細(xì)胞株 MDA－MB－231購自美國ATCC細(xì)胞庫。

2.試劑

兔抗人c－Met多克隆抗體均購于Santa Cruz公司，beta－actin單克隆抗體購于Neomark公司產(chǎn)品。通用型兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑均購于福州邁新公司。南美胎牛血清和L15培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。RIPA細(xì)胞裂解蛋白提取試劑、BCA－100法蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒為上海申能博彩生物科技公司產(chǎn)品。特異性c－Met siRNA購自上海吉瑪生物技術(shù)公司，序列為5＇－GCCCAACUACAGAAAUGGUTT－3＇ （sense） and 5＇－ACCAUUUCUGUAGUUGGGCTT－3＇（antisense）。

3.方法

3.1 免疫組織化學(xué)兩步法染色

切片經(jīng)檸檬酸鈉緩沖液加熱抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。具體操作按說明書染色步驟進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA－MB－231細(xì)胞應(yīng)用L15培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，但不添加抗生素），置于含5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.3 細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染

3.3.1 細(xì)胞準(zhǔn)備

MDA－MB－231細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天，分細(xì)胞至6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/孔，每孔中加入不加抗生素的培養(yǎng)基1.5ml，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%－50%。

3.3.2 轉(zhuǎn)染

用前輕輕搖勻轉(zhuǎn)染試劑Lipo，然后在不含血清的培養(yǎng)基250μl中稀釋3μl的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine至1.5ml的EP管中。輕輕混和且在室溫孵育5min。在另一個(gè)1.5ml的EP管中，在不含血清的培養(yǎng)基250μl中稀釋siRNA 50nmol，輕輕混和。經(jīng)過5min的室溫孵育后，將稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine輕輕混和，室溫孵育20min以形成FAM－siRNA－Lipo混和物。將siRNA－Lipo混和液均勻滴入每個(gè)含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的孔中。輕輕左右、上下?lián)u晃孔板，使混和。在含5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)48h收集細(xì)胞，RIPA法提取總蛋白，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

陰性siRNA對(duì)照組和c－Met siRNA實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)3孔。

3.4 Western blotting（SDS－PAGE電泳）

檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中c－Met蛋白表達(dá)水平，以betaactin為內(nèi)參照。c－Met一抗?jié)舛葹?∶1000，二抗?jié)舛葹?∶10000，電泳100V 恒壓，電轉(zhuǎn)100V，100min。

4.免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

c－Met蛋白以細(xì)胞漿出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，按Graveel等［1］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量分析，大于等于10%的細(xì)胞染色視為陽性表達(dá)。ER、PR陽性定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色顆粒，大于等于10%的細(xì)胞染色視為陽性表達(dá)。C－erbB－2以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為判斷標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞膜未著色或10%的著色為（﹣），＞10%細(xì)胞呈微弱且不完整著色為（＋），＞10%細(xì)胞呈弱－中等強(qiáng)度完全著色為（＋＋），＞10%細(xì)胞呈強(qiáng)的完全著色為（＋＋＋）。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS（10.0for window）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。樣本率之間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量間的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白的表達(dá)和分布

c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白陽性信號(hào)均呈黃色或棕黃色顆粒狀，主要定位于細(xì)胞漿，三者在乳腺癌細(xì)胞中染色較強(qiáng)，分布呈異質(zhì)性，間質(zhì)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見少許表達(dá)。c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)情況如圖（圖1－3）。86例乳腺癌組織中，c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白陽性率分別為58.1%、69.8%和62.8%。

圖1 乳腺癌c－Met蛋白陽性表達(dá)（免疫組化兩步法×400）Fig.1 The positive expression of c－Met protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

圖2.乳腺癌MMP－2蛋白陽性表達(dá)（免疫組化兩步法×400）Fig.2 The positive expression of MMP－2protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

圖3.乳腺癌MMP－9蛋白陽性表達(dá)（免疫組化兩步法×400）Fig.3 The positive expression of MMP－9protein in breast cancer（immuno histochemical technique of two steps×400）

2.c－Met蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

由表1所示：乳腺癌組織c－Met蛋白表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、雌孕激素和c－erbB－2表達(dá)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。我們進(jìn)一步分析c－Met表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系：采用Kaplan－Meier曲線法和Log－rank檢驗(yàn)對(duì)乳腺癌c－Met表達(dá)與患者五年總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）關(guān)系進(jìn)行單因素生存分析：c－Met蛋白陽性患者OS顯著低于陰性患者（52.8月和60.5月，P＝0.018），并且c－Met蛋白陽性患者RFS也顯著低于陰性患者（44.6月和56.0月，P＝0.024）。

3.乳腺癌c－Met與 MMP－2及MMP－9的關(guān)系

我們采用了Spearman相關(guān)性分析檢測(cè)乳腺癌組織中c－Met與 MMP－2及MMP－9的關(guān)系。相關(guān)性分析顯示：乳腺癌c－Met和MMP－2及MMP－9表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r＝0.314和0.322，均P＜0.01）。同時(shí)，我們通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合siRNA技術(shù)檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞中c－Met與 MMP－2及MMP－9的關(guān)系。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了c－Met siRNA的乳腺癌 MDA－MB－231細(xì)胞的 MMP－2和MMP－9表達(dá)量較對(duì)照組明顯下調(diào)（圖4）。

圖4 western blot法檢測(cè)MDA－MB－231細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組c－Met、MMP－2和MMP－9蛋白表達(dá)Figure 4.The expression of c－Met，MMP－2and MMP－9in MDA－MB－231cells between experimental group and control group by western blot assay

表1 c－Met蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table1 Association of c－Met expression withclinicopathologic parameters from breast cancer patients

討 論

惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多階梯瀑布進(jìn)程，經(jīng)過腫瘤細(xì)胞間的粘附力減少、腫瘤細(xì)胞與基底膜的緊密附著、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及腫瘤細(xì)胞的遷移等一系列過程，最終使得腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位游走，在繼發(fā)處形成轉(zhuǎn)移灶。在這些過程中腫瘤細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)是重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

c－Met原癌基因位于人類7號(hào)染色體長臂（7q31），主要存在于上皮細(xì)胞的胞膜和胞漿中，是受體酪氨酸蛋白激酶家族中的成員，也是肝細(xì)胞生長因子（HGF）的單一受體。HGF具有很強(qiáng)的促進(jìn)有絲分裂的作用，通過作用于c－Met受體可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞離散和遷移。研究發(fā)現(xiàn)，c－Met和HGF信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)惡性腫瘤組織的許多生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，特別是能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3，4］。在乳腺癌研究中，Lindemann等［5］使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了39例乳腺導(dǎo)管原位癌的c－Met表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織c－Met表達(dá)顯著高于癌旁正常乳腺組織；Garcia等［6］大樣本檢測(cè)了930乳腺癌c－Met蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)c－Met過表達(dá)與乳腺癌患者生存期呈顯著負(fù)相關(guān)；國內(nèi)王承正［7］等研究也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌c－Met蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：乳腺癌組織c－Met蛋白表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均呈顯著正相關(guān)，而與患者的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期均呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示c－Met在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

MMP－2和MMP－9是明膠酶的兩個(gè)成員，由于它們能夠特異性降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程了直接發(fā)揮了的重要作用［8，9］。鑒于c－Met也參與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程，因此，我們推測(cè)MMP－2和MMP－9可能是c－Met下游的基因，即c－Met可能通過調(diào)控MMP－2和MMP－9的表達(dá)發(fā)揮其促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。為此，我們同時(shí)也檢測(cè)了乳腺癌組織中 MMP－2和MMP－9的表達(dá)。通過相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌c－Met蛋白表達(dá)與MMP－2和MMP－9均呈顯著正相關(guān)，提示三者之間可能關(guān)系密切。進(jìn)一步，我們使用特異性靶向c－Met基因的siRNA在體外轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外源性下調(diào)乳腺癌細(xì)胞c－Met表達(dá)后，MMP－2和MMP－9的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)，結(jié)果證實(shí)了乳腺癌組織中的結(jié)果。目前關(guān)于乳腺癌c－Met與 MMP－2和MMP－9關(guān)系的研究似未見報(bào)道。在其它腫瘤中，Naka等［10］使用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了脊索瘤中c－Met和MMP－2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)。Zhou等［11］對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)，MMP－9參與了HGF/c－Met介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的過程。這些研究結(jié)果我們的結(jié)果提示c－Met可能參與了乳腺癌細(xì)胞MMP－2和MMP－9的調(diào)控通路。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)c－Met與乳腺癌局部侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是輔助判斷乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物之一。并且c－Met可能是通過調(diào)控MMP－2和MMP－9表達(dá)參與了乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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