劉 果，何永紅，萬呼春，鐘曉波，齊 進(jìn)△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院400015；2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川大學(xué)，成都610041；3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院內(nèi)科，成都610041）

變異鏈球菌（streptococcus mutans，以下簡稱變鏈菌）屬革蘭陽性球菌，以其較強(qiáng)的產(chǎn)酸、耐酸及黏附能力成為牙菌斑生物膜中的優(yōu)勢菌，是導(dǎo)致齲病的重要致病菌之一［1］。目前，已有研究表明，多種藥物成分可有效抑制變鏈菌生長，但具體作用機(jī)制未知。雙向電泳（two－dimensional electrophoresis，2DE）作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，能夠?qū)f種蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離，動(dòng)態(tài)分析細(xì)菌蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，在研究致齲機(jī)制、藥物抑菌機(jī)制等方面具有重要意義［2－4］。而如何增大樣品蛋白質(zhì)的提取量并提高其溶解度是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵步驟［5］。超聲法破碎細(xì)菌提取樣品蛋白質(zhì)是常用方法，本研究采用超聲法破碎細(xì)菌，并對(duì)如何提高蛋白質(zhì)的提取效率進(jìn)行研究，為開展變鏈菌的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行探索，為變鏈菌致齲機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 變異鏈球菌ATCC25175（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），TPY培養(yǎng)基，裂解液（30 mmol/L Tris－Hcl，7mol/L脲，2mol/L硫脲，4%CHAPS，1%DTT，5mmol/L PMSF），RC DC 蛋白定量試劑盒（BIO－RAD公司，美國），超聲破碎儀（Sanyo公司，日本），微型垂直電泳系統(tǒng)和BIO－RAD 2000凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO－RAD 公 司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及收集 細(xì)菌復(fù)蘇后接種TPY瓊脂平板，37℃兼性厭氧（80%N2，10%H2，10%CO2）培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種TPY液體培養(yǎng)基，37℃兼性厭氧培養(yǎng)18h，收集菌懸液。4℃12 000×g離心10min，棄上清液，細(xì)菌沉淀用含氯霉素（100μg/mL）雙蒸水洗滌2次后重懸于不含氯霉素的雙蒸水中。調(diào)整菌懸液Mcf（麥?zhǔn)现担?.8左右，濃縮40倍后將菌懸液按每管1mL分裝于離心管中，4℃12 000×g離心10 min，收集菌沉淀，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 超聲破碎菌體 ?。?0℃保存的菌沉淀，加入裂解液1mL，冰浴條件下采用超聲法（超聲功率300～350W，工作9.9s，間歇9.9s，循環(huán)152次）裂解細(xì)菌。超聲結(jié)束時(shí)將菌懸液振蕩混勻。

1.2.3 掃描電鏡觀察裂解前、后菌體形態(tài) 分別取等量裂解前和裂解后菌懸液。將細(xì)菌懸液與等量5%戊二醛混合，4℃固定過夜。經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）液（pH7.2）洗3次，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為108～107CFU。取10μL滴于1cm×1cm大小載玻片上，50℃干燥10min使細(xì)菌固定。30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%梯度乙醇梯度脫水各10min，由醋酸異戊酯浸泡2h。常規(guī)臨界點(diǎn)干燥，鍍金，掃描電鏡觀察樣本。

表1 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本吸光度A值（s，CV，n＝3）

表1 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本吸光度A值（s，CV，n＝3）

0min 10min 30min 50min 70min平行樣.84 2.18 2.03 4.87 0.93 2.89

1.2.4 提取不同放置時(shí)間點(diǎn)菌懸液蛋白 將超聲破碎后的菌懸液分裝于1mL滅菌EP管中，分別編號(hào)為a、b、c、d、e，對(duì)應(yīng)室溫中放置時(shí)間0、10、30、50、70min。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)平行管。放置時(shí)間結(jié)束后，各管分別振蕩混勻，然后4℃16 060×g離心10min，取上清液進(jìn)行分析。

1.2.5 SDS－PAGE測定不同放置時(shí)間蛋白質(zhì)構(gòu)成的差異 按《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》制備SDS－PAGE，濃縮膠為5%，分離膠為12%。取各時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)提取液20uL，分別加入上樣緩沖液混勻制成電泳樣本。將電泳樣本注入SDS－PAGE加樣孔中，濃縮膠80V電泳30min，分離膠120V電泳90min停止?？捡R斯亮藍(lán)染色30min，再用脫色液脫色至背景清晰。每個(gè)電泳樣本重復(fù)2孔，電泳及染色重復(fù)3次。凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并采集圖像。

1.2.6 RC DC法測定不同時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)濃度

1.2.6.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列配制 稱取一定量BSA溶解于提取液對(duì)照中，配制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為0、0.25、0.5、0.75、1.0和1.5mg/mL。

1.2.6.2 蛋白質(zhì)濃度測定 從各時(shí)間點(diǎn)的上清液中分別取25μL于EP管。按照RC DC試劑盒說明操作，取最終的反應(yīng)液200μL于96孔板中，在750nm波長處測定每孔的吸光度值（A）。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌破碎程度分析 未處理的變鏈菌收集后互相重疊呈團(tuán)聚狀，數(shù)量多，密度大，如圖1A所示。高倍鏡下觀變鏈菌菌體形態(tài)完整飽滿，在同一平面上分裂并相互粘連，如圖1B所示。超聲處理后絕大部分細(xì)菌破碎成絮狀碎片，僅見極少量破裂不完全和形態(tài)完整的細(xì)菌，如圖1C、D所示。

2.2 放置時(shí)間對(duì)提取蛋白質(zhì)構(gòu)成成分的影響 圖2為裂解后從放置不同時(shí)間后的菌懸液中提取的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由圖顯示放置不同時(shí)間后裂解液中的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS－PAGE分離后的條帶分布完全一致，同時(shí)條帶豐度也無明顯差異。

2.3 放置時(shí)間對(duì)提取蛋白質(zhì)濃度的影響 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝0.118 9 X－0.002，相關(guān)系數(shù)為 0.996 1，其中 X為蛋白質(zhì)濃度，Y為吸光度值。各時(shí)間點(diǎn)上清液樣本的3個(gè)平行孔的變異系數(shù)CV（%）范圍在0%～2.9%之間。各時(shí)間點(diǎn)4個(gè)平行樣本吸光度值變異系數(shù)CV（%）范圍為0.93%～4.87%之間，結(jié)果見表1。各時(shí)間點(diǎn)上清液的蛋白質(zhì)濃度見圖3所示。由圖可見，超聲結(jié)束后室溫放置30min時(shí)裂解液中蛋白質(zhì)含量最高。對(duì)5組進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示放置30min和70min時(shí)裂解液中的蛋白質(zhì)含量均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，放置30min時(shí)裂解液中的蛋白質(zhì)含量顯著高于70min時(shí)（P＜0.05）；而放置0、10和50min的裂解液中的蛋白質(zhì)含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 超聲裂解前、后的變鏈菌形態(tài)

圖2 裂解后放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)SDS－PAGE圖譜

圖3 放置不同時(shí)間提取的蛋白質(zhì)樣本質(zhì)量濃度

3 討 論

變異鏈球菌屬于革蘭陽性菌，細(xì)胞壁厚且堅(jiān)韌難以破碎，一般采用的破碎方法有反復(fù)凍融結(jié)合超聲法、氧化鋁粉末混合研磨法、玻璃珠勻漿法以及高壓法等［6－8］。超聲波破碎法是目前提取細(xì)菌蛋白時(shí)常用的技術(shù)手段［9－10］。Thongboonkerd等［11］研究認(rèn)為僅通過超聲即可使化膿性鏈球菌達(dá)到80%的破碎，但無明確評(píng)價(jià)細(xì)菌破碎程度的指標(biāo)。超聲破碎法在大大提高蛋白質(zhì)提取效果的同時(shí)，還能增加蛋白質(zhì)的溶解性［12］，且可避免外源性蛋白質(zhì)對(duì)樣本的污染［13］。已有實(shí)驗(yàn)表明超聲破碎變鏈菌效果明顯［9，14］，而在變鏈菌蛋白質(zhì)組研究中，如何提取樣本的最大量對(duì)結(jié)果至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)將超聲破碎結(jié)束的變鏈菌菌懸液分別放置不同時(shí)間，在菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)充分溢出并溶解后，對(duì)其中的蛋白進(jìn)行構(gòu)成及量的測定，探索放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)提取效率的影響。SDS－PAGE電泳可根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的不同分離混合蛋白質(zhì)，是分析各蛋白質(zhì)構(gòu)成變化的有效手段［14］。本實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果顯示，超聲后放置不同時(shí)間的菌懸液中蛋白質(zhì)的條帶分布及豐度基本相同，提示放置時(shí)間對(duì)菌懸液中蛋白質(zhì)的構(gòu)成無明顯影響，但對(duì)濃度的影響無法通過SDS－PAEG電泳精確展示。本實(shí)驗(yàn)采用的RC DC試劑盒法以Lowry法為基礎(chǔ)，并能夠兼容裂解液中多種試劑成分，同其他蛋白質(zhì)定量測定方法相比，具有精密度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)［15－16］。定量結(jié)果表明，超聲破碎后放置30min的菌懸液中蛋白質(zhì)的濃度最高；放置時(shí)間少于30min的菌懸液，隨時(shí)間的延長蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，而超過30min所提取的蛋白質(zhì)隨時(shí)間的延長濃度下降。

經(jīng)掃描電鏡觀察，大部分細(xì)菌破裂后呈絮狀碎片，極小部分細(xì)菌呈現(xiàn)清晰的殘余菌體形態(tài)，個(gè)別變鏈菌菌體較為完整。提示胞壁破裂完全的細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)已充分外流，蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放較徹底。而形態(tài)完整的細(xì)菌胞壁上可能存在有較小的裂口，猜測它們和存在殘余菌體的變鏈菌胞內(nèi)物質(zhì)的釋放需要一定時(shí)間完成。在測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度時(shí)，需保證菌體內(nèi)釋放的蛋白質(zhì)充分溶解于提取介質(zhì)中。而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的釋放量少，或出現(xiàn)蛋白降解、沉淀等情況時(shí)，即導(dǎo)致提取介質(zhì)中蛋白質(zhì)的溶解減少，使測量濃度偏低。本實(shí)驗(yàn)采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破壞蛋白質(zhì)之間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集。還原劑DTT能夠幫助打開蛋白質(zhì)的二硫鍵，促進(jìn)半胱氨酸殘基被還原，使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。而蛋白酶抑制劑PMSF可有效抑制細(xì)菌自身所釋放的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解。由數(shù)據(jù)可看出，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與裂解后放置時(shí)間在0～30min范圍內(nèi)成正相關(guān)。由此提示，一方面，蛋白質(zhì)的釋放可能隨時(shí)間的延長增加；另一方面，提取介質(zhì)中復(fù)雜的試劑成分與蛋白質(zhì)、水解酶的相互作用可能并沒有伴隨裂解過程的結(jié)束而終止，而在裂解后的一段時(shí)間內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行。同時(shí)，蛋白酶抑制劑PMSF主要抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶，而菌體內(nèi)釋放的其他蛋白酶可能仍存在活性，它們在溶解后與蛋白質(zhì)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度的降低。但放置30～70min與蛋白質(zhì)濃度的相關(guān)性無明顯規(guī)律，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探索。

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