李 軍，陶 立，蘭美益，陳澤祥，韋志鋒，秦若甫，彭 昊，楊 威＊

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）是雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）的病原體。IBDV感染幼齡雞后，主要在法氏囊髓質(zhì)區(qū)的未成熟B淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞中增殖，引起感染細(xì)胞的變性和壞死，臨床上出現(xiàn)以法氏囊水腫、出血和萎縮為特征的病理變化[1－2]。IBDV在雞群中的傳播不僅導(dǎo)致易感雞群的大量死亡，IBDV的殺淋巴細(xì)胞作用還能引起雞群的免疫應(yīng)答能力降低，使雞群對其他病毒或細(xì)菌感染的敏感性增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3－4]。近十幾年來，隨著IBDV疫苗的廣泛應(yīng)用，IBDV在疫苗免疫選擇壓力下，自身不斷發(fā)生變異，毒力獲得增強，出現(xiàn)經(jīng)典毒株（classical IBDV，cIBDV）向超強毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）的演化，vvIBDV可以突破高水平的母源抗體保護(hù)，導(dǎo)致雞發(fā)病年齡提前和病死率增高，給IBD的防控帶來了困難。

IBDV屬于雙RNA病毒科、禽雙RNA病毒屬成員，基因組由A、B兩個雙鏈RNA片段組成[5]。A片段的VP2基因是IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2的編碼基因，VP2蛋白位于病毒粒子的外表面，是IBDV的主要毒力因子，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[6]。研究證實VP2序列中的VP2高變區(qū)（vVP2）與IBDV的毒力密切相關(guān)。vVP2位于VP2蛋白的第206～350位氨基酸之間，由大小兩個親水區(qū)和一個七肽區(qū)組成，構(gòu)成一個構(gòu)象依賴型的抗原表位，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體。vVP2內(nèi)氨基酸的改變會引起IBDV 毒力的改變[7－9]。

陽秀英等和何秀苗等2000年—2007年對廣西雞群IBDV的分子流行病學(xué)研究表明，廣西雞群中主要流行vvIBDV，各地毒株來源復(fù)雜，部分IBDV毒株的抗原性可能發(fā)生漂移[10－11]。2011年7月，廣西南寧市某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的23日齡三黃雞暴發(fā)了一起IBD，病死率為6%。本研究對病死雞進(jìn)行了IBDV分離和鑒定，并對其vVP2進(jìn)行克隆和測序，將獲得的vVP2序列與廣西流行的IBDV毒株vVP2序列進(jìn)行比較分析，建立遺傳進(jìn)化樹，從分子水平上對廣西近期IBDV的變異情況進(jìn)行追蹤和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自廣西南寧市某養(yǎng)雞場的臨床疑似IBD的病死雞，采其法氏囊作為病料。

1.1.2 雞胚 9日齡健康雞胚，購自廣西華桂源種禽有限公司。

1.1.3 試劑和儀器 PCR Taq mix、DNA Marker 1、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18－T載體、RNA酶抑制劑和 MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR儀購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 病毒的分離方法按陽秀英等的方法進(jìn)行[10]。

1.2.2 病毒分離株RNA的提取 用病毒基因組DNA／RNA提取試劑盒提取接種病毒的雞胚尿囊液中的總RNA，方法按說明書進(jìn)行。

1.2.3 病毒分離株vVP2基因的擴增、克隆和測序按韋平等的方法進(jìn)行IBDV的RT－PCR檢測[12]。利用DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。回收純化后與pMD－18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 分離株vVP2序列的遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用DNA Star軟件包的MegAlign軟件對測序獲得的vVP2片段序列與GenBank登錄的5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸的序列比較和同源性分析，繪制遺傳進(jìn)化樹。分析中應(yīng)用的毒株信息見表1。

表1 所用的IBDV毒株信息Table1 The information of IBDV strains used in this study

2 結(jié)果

2.1 病毒分離和鑒定

發(fā)病雞的法氏囊研磨過濾后經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種9日齡健康雞胚，雞胚在43h后死亡，胚體表現(xiàn)為水腫和出血。取尿囊液進(jìn)行血凝試驗和細(xì)菌培養(yǎng)檢測均為陰性。應(yīng)用韋平等[12]的方法對雞胚尿囊液進(jìn)行IBDV的RT－PCR檢測，擴增出471bp的目的片段，證實從病料中分離到了IBDV，將此毒株命名為NN1107。

2.2 分離株vVP2序列的比較分析

2.2.1 核苷酸序列同源性比較 對NN1107分離株的vVP2進(jìn)行克隆和測序，獲得了NN1107分離株vVP2核苷酸序列，長度為471bp。對序列進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點檢測，在271位核苷酸處有一個vvIBDV的特征性SspI酶切位點。將此序列與廣西野毒株和疫苗株的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，NN11017株與廣西vvIBDV毒株的同源性在96%～99.6%之間，其中與野毒株 NN07122和HP1001的同源性最高，為99.6%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在90.3%～91.6%之間；與疫苗株的同源性則在90.3%～96.6%之間。

2.2.2 氨基酸序列同源性比較 將推導(dǎo)的氨基酸序列與廣西野毒株和疫苗株的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，NN1107株與廣西vvIBDV毒株的同源性在94.9%～99.4%之間，其中與野毒株 BH09、NNTZ（3）、NN07122和 HP1001的同源性最高，為99.4%。NN1107株與廣西cIBDV毒株的同源性在91.1%～93%之間；而與疫苗株的同源性在91.8%～97.5%之間，其中與 B87（in）、Bursine－2、FW2512株的同源性均為91.8%；與 B87（BJ）和MB株的同源性則為93%和97.5%。

2.2.3 氨基酸序列分析 NN1107株vVP2氨基酸序列中與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸均符合vvIBDV 特 征[13－14]，即第326～332位的七肽區(qū)SWSASGS序列保持不變；大親水一區(qū)（第212～224位氨基酸）內(nèi)212、213、214和222位氨基酸為N、D、Y和A；大親水二區(qū)（第314～324位氨基酸）內(nèi)318、321、323和324位氨基酸為G、G、D和Q；小親水一區(qū)（第248～252位氨基酸）內(nèi)249位氨基酸為Q；小親水二區(qū)（第279～290位氨基酸）279和284位氨基酸為D和T。其他與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點，如第242、253、254、256、270、294、299和330位氨基酸分別為I、Q、G、I、A、I、S和S。NN1107株與廣西部分野毒株和疫苗株的vVP2氨基酸序列比較見圖1。

圖1 vVP2的氨基酸序列比較Fig.1 Comparison of the amino acid sequences of vVP2

2.3 分離株vVP2序列的遺傳進(jìn)化分析

將NN1107株與5株IBDV疫苗株和26株2000年—2010年在廣西流行的IBDV野毒株的vVP2核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，繪制遺傳進(jìn)化樹（圖2）?？梢园l(fā)現(xiàn)遺傳進(jìn)化樹由vvIBDV毒株、cIBDV毒株和疫苗株3個群組成，群間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。NN1001株屬于vvIBDV毒株群，它與曾經(jīng)在2004年、2005年、2007年和2010年流行的毒株BH09、NNTZ（3）、NN07122、HP1001的親緣關(guān)系最近，共同組成亞群2；而2006年、2007年和2010年的大部分毒株以及2004年至2005年流行的大部分毒株分別組成亞群1和亞群3。

圖2 根據(jù)vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolate and reference strains based on the nucleotide sequences of vVP2

3 討論

采用雞胚絨毛尿囊膜接種和RT－PCR檢測技術(shù)對臨床疑似IBD的病死雞法氏囊進(jìn)行IBDV的分離和鑒定，成功分離出一株IBDV（NN1107株）。對NN1107分離株vVP2片段進(jìn)行克隆和測序，序列分析和同源性比較結(jié)果顯示，NN1107株具有vvIBDV的特征性酶切位點SspI，且與廣西vvIBDV野毒株的同源性極高，表明NN1107株為一株vvIBDV。

VP2蛋白不僅是IBDV的一個主要結(jié)構(gòu)蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，還是一個變異最大的蛋白，其變異主要集中在vVP2區(qū)域（第206～350位氨基酸），vVP2內(nèi)氨基酸的改變都有可能使病毒的毒力增強，突破疫苗的免疫保護(hù)[7－9]。因此，可以通過vVP2序列的同源性比較來分析毒株的遺傳進(jìn)化。vVP2氨基酸序列同源性比較和遺傳進(jìn)化分析顯示，在近10年，廣西同時存在著cIBDV和vvIBDV兩種不同毒力的IBDV毒株流行。本研究分析的27株IBDV毒株中，只有7株毒株屬于cIBDV，且毒株大都分離于2005年以前，只有1株BB0901是分離于2009年；而vvIBDV毒株分離自2004年至2011年，表明廣西目前IBDV的主要流行毒株仍然為vvIBDV。

NN1107株與2004年毒株BH09、2005年毒株NNTZ（3）、2007年毒株 NN07122和2010年毒株HP1001的同源性高達(dá)99.4%；其主要氨基酸位點也未發(fā)生任何改變，說明這些毒株很有可能來源于同一病毒株的進(jìn)化。本研究構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹也顯示vvIBDV在進(jìn)化中也分成2個亞群，在同一地區(qū)，如位于桂南地區(qū)的南寧市和位于桂北地區(qū)的桂林市都存在有不同亞群的vvIBDV，表明廣西vvIBDV來源復(fù)雜，流行不受地域限制。

從vVP2核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹可以看出，NN1107株等vvIBDV毒株與傳統(tǒng)的疫苗株B87（in）、Bursine－2、FW2512株分屬于兩個基因群。在與病毒毒力和抗原相關(guān)的氨基酸位點中，有10個位點，即第212、222、249、256、270、279、284、286、294和299位的氨基酸發(fā)生了改變。這些氨基酸的改變可能會導(dǎo)致中和抗體識別的抗原表位發(fā)生構(gòu)象上的變化，使疫苗株 B87（in）、Bursine－2、FW2512株誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體不能有效地與病毒結(jié)合，阻斷vvIBDV感染B淋巴細(xì)胞，這可能是vvIBDV突破高水平母源抗體保護(hù)的原因。

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