王 赟，梅 淼，楊 雪，朱 玲

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 雅安 625014）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（PMWS）的主要病原體，已被世界各國(guó)的學(xué)者所認(rèn)同[1]。PMWS發(fā)生自1991年在加拿大被首次報(bào)道后，美國(guó)、法國(guó)、西班牙、德國(guó)、日本都進(jìn)行了報(bào)道，在北美和歐洲的豬群中，發(fā)病率占被侵襲豬群的5%～50%，病死率達(dá)到50%～100%[2－3]。病原學(xué)和血清學(xué)調(diào)查證實(shí)，PCV－2呈世界性分布[4]。根據(jù)致病性、抗原性和核苷酸序列，PCV可分為PCV－1和PCV－2兩個(gè)血清型，PCV－1無致病性，PCV－2有致病性。國(guó)內(nèi)外研究表明，PCV－1基因胞為1759bp，PCV－2則有1767bp和1768bp兩種[5]。PCV－2毒株間核苷酸序列的相似性大于96%，PCV－2與PCV－1的相似性小于80%。世界各地的PCV－2分離株的核苷酸序列具有很高的同源性，但在不同地域間病毒基因組序列仍存在變異，這種差異可能與PCV－2的感染特性有關(guān)[6]。該病的主要癥狀為漸進(jìn)性消瘦，呼吸困難及黃疸，剖檢可見淋巴組織退化，間質(zhì)性肺炎，肝炎及腎炎。除了能引起PMWS之外，PCV－2還與豬的幾種新出現(xiàn)傳染病的發(fā)生密切相關(guān)，包括豬呼吸道病綜合征（PRDC）及豬增生性和壞死性肺炎（PNP）、新生仔豬的先天性震顫（CT）和新生仔豬的腹瀉病等[7]。2000年郎洪武等[8]首次報(bào)道中國(guó)豬群存在PCV－2感染，感染率為42.9%。而2007年周緒斌等[8]報(bào)道在2000年－2005年期間20多個(gè)省市PCV－2感染平均陽性率達(dá)55.04%。如今PCV－2及其所致的相關(guān)疾病引起了獸醫(yī)界的高度重視，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

本試驗(yàn)從所采典型PMWS病料中分離鑒定出PCV－2，并對(duì)PCV－2全基因組的擴(kuò)增、克隆和序列分析，并與GenBank中的PCV－2參考毒株進(jìn)行同源性比較，以期為四川省PCV－2的流行病學(xué)研究、診斷與防控、基因組學(xué)的完善，及其進(jìn)一步闡明其致病機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 選疑似典型斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病例的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織，病料采集自四川某規(guī)?；i場(chǎng)，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌種 PK－15細(xì)胞購自武漢病毒所細(xì)胞保管中心（經(jīng)PCV－1及PCV－2檢測(cè)為陰性），限制性內(nèi)切酶 BamHⅠ、HindⅢ、pMD18－T Simple載體（寶生物工程大連有限公司），DH5α宿主菌，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 采用Fenaux M 等[10]所設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增PCV－2全基因組為1767bp或1768bp的特異引物序列，擴(kuò)增四川省PCV－2毒株的全基因組，并在上下游引物中引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物 序 列 為 P1，5′－GAAGGATCCCTGGCTAACTTTGAAAGT－3′；P2，5′－GCAAAGCTTAATTCTGACAACGTTACA－3′。

1.2 方法

1.2.1 病料的PCR擴(kuò)增 將采集的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料，剪成小塊，移入勻漿器內(nèi)，按1∶10（W／V）加入PBS液將其研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)凍融3次。按常規(guī)的酚／氯仿法提取病毒基因組DNA，并以提取的目的DNA為模板進(jìn)行如下PCR擴(kuò)增：50μL反應(yīng)體系（5μL10×bufffer、3μL 25mmol／L MgCl2、1μL 10mmol／L dNTPs、20 μmol／L P1和P2各1.0μL、Taq酶0.5μL、模板3 μL、超純水補(bǔ)足50μL），于94℃變性5min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（94℃1min，56℃1min，72℃30s），最后72℃延伸10min。用10g／L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結(jié)果。

1.2.2 PK－15細(xì)胞PCV－1、PCV－2污染測(cè)定 取出1mL經(jīng)胰酶消化完全的單層PK－15細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次，讓細(xì)胞充分破裂，完全釋放出病毒粒子。12000r／min 4℃離心5min，取上清液備用。按照1.2.1的PCR反應(yīng)體系來檢測(cè)PK－15細(xì)胞是否含有PCV－1、PCV－2核酸污染，選擇檢測(cè)結(jié)果為陰性的單層細(xì)胞備用。

1.2.3 病毒的分離 用無菌PBS液將經(jīng)1.2.1檢測(cè)為PCV－2陽性的相對(duì)應(yīng)的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料研磨制成1∶5（病料與PBS液體積比）的懸液，反復(fù)凍融3次，4000r／min離心30min，取上清過0.22μm濾器除菌，加入青霉素1000單位／mL，鏈霉素1000μg／mL，4℃作用6h，保存?zhèn)溆?。取上述處理好的組織樣品1mL，接種按常規(guī)方法消化制備致密PK－l5細(xì)胞單層，同時(shí)設(shè)不接種病毒的PK－15細(xì)胞作空白對(duì)照，37℃吸附作用1h，加入適量含20 mL／L小牛血清的維持營(yíng)養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)72h。將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，3000r／min離心10min，收獲上清。用上一代細(xì)胞病毒液再接種細(xì)胞連續(xù)盲傳15代后收獲病毒。

1.2.4 熒光抗體染色法檢測(cè) 將已收獲的病毒接種長(zhǎng)有致密單層的PK－15細(xì)胞[11]，按熒光抗體染色法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)步驟制備樣品，最后經(jīng)超純水沖洗，冷風(fēng)吹干，以0.5mol／L pH9.5的碳酸鹽緩沖甘油封固蓋片，鏡檢，觀察有無特異性熒光。

1.2.5 分離株的鑒定及全基因組的克隆 取出已經(jīng)長(zhǎng)成單層的接有病毒的PK－15細(xì)胞反復(fù)凍融3次，讓細(xì)胞充分破裂，釋放出病毒。在4℃以12000 r／min離心5min，取上清液，按照以上PCR反應(yīng)體系檢測(cè)，如果電泳結(jié)果為陽性則用PCR回收試劑盒回收特異的擴(kuò)增片段。將回收的基因片段與克隆載體pMD18－T Simple連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.6 序列測(cè)定與全序列進(jìn)化分析 對(duì)經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海英俊生物有限公司測(cè)序。然后利用DNA Star軟件分析所得PCV－2的基因組序列并與Gen Bank中公布的其他國(guó)內(nèi)外毒株進(jìn)行序列比較分析和進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

病毒在接種PK－15細(xì)胞后的間接免疫熒光方法檢測(cè)結(jié)果顯示：感染病毒的陽性細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，病毒抗原主要集中在細(xì)胞核區(qū)，細(xì)胞質(zhì)中也有許多抗原分布，病毒感染的陽性細(xì)胞呈散在分布；陰性對(duì)照細(xì)胞中未見熒光（圖1）。

2.2 PCV－2全基因組擴(kuò)增結(jié)果及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

應(yīng)用合成的引物通過反向PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1800bp的片段，與預(yù)期目的片段大小一致（圖2）。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，顯示出長(zhǎng)度約為2600 bp和1800bp的特異性片段，結(jié)果表明克隆成功（圖3）。

圖1 間接免疫熒光鑒定PCV－2病毒粒子在PK－15細(xì)胞中的增殖Fig.1 Immunofluorescence identification of infection on PK－15cells infected with PCV－2

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The results of PCR amplication

2.3 序列測(cè)定與分析

陽性重組質(zhì)粒經(jīng)上海英俊生物有限公司測(cè)序，去除酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基，得到長(zhǎng)為1767bp的外源片段，該片段與預(yù)期結(jié)果完全相符（圖3）。通過BLAST與GenBank中來自加拿大、新西蘭及中國(guó)其他部分的PCV－2毒株進(jìn)行相似性比較分析，結(jié)果與13個(gè)毒株間的相似性介于95.2%～99.5%（圖4）。該結(jié)果表明從所采病料中成功分離了PCV－2四川株。PCV2－SC分離株與山東株（AY556473）親緣關(guān)系最近，相似性高達(dá)99.7%；與日本株（AY424401）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，相似性只有94.8%。根據(jù)比較結(jié)果繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），可以看出澳大利亞株（AY424401）構(gòu)成了一個(gè)獨(dú)立的分支，PCV2－SC株分離株與山東株共同組成一組微小分支，且這兩株與加拿大株、新西蘭株和中國(guó)的其他分離株構(gòu)成了另外一個(gè)大的分支?？傮w看來，由于地域原因，國(guó)內(nèi)毒株同源性均較高，且與國(guó)外毒株新西蘭株同源性較近。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

圖4 PCV－2（SC）與其它PCV－2毒株的相似性比較Fig.4 Similarity comparison of the full genome sequence of PCV－2（SC）strain with other PCV－2isolates

圖5 PCV－2－SC全基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Phylogenetic tree based on complete genome sequence of PCV－2－SC strain

3 討論

PMWS是近10多年來出現(xiàn)的影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，PCV－2是引起該病的主要病原，但不是惟一病原，PCV－2單獨(dú)感染可出現(xiàn)輕微的病變[12]。臨床上出現(xiàn)的PMWS病例多為PCV－2、豬細(xì)小病毒（PPV）及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的混合感染，尤其是最近幾年暴發(fā)的豬高致病性藍(lán)耳?。锤咧虏⌒载i繁殖與呼吸綜合征），更是伴隨有 PCV－2 的感染[13－14]。在對(duì) PCV－2進(jìn)行分離鑒定時(shí)考慮了兩個(gè)問題，即克服PCV－1的干擾和檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。在試驗(yàn)中選擇經(jīng)能區(qū)分PCV－1和PCV－2的PCR特異引物檢測(cè)PK－15細(xì)胞是否含有PCV－1和PCV－2污染，檢測(cè)結(jié)果為陰性后。間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)接種PCV－2－SC株的PK15細(xì)胞，盲傳培養(yǎng)15代次后獲得了滿意結(jié)果。

在設(shè)計(jì)引物時(shí)通過反復(fù)比較PCV－1和PCV－2的序列差異，選擇在PCV－1和PCV－2毒株間變異較大，相對(duì)于PCV－2毒株間保守性較高的區(qū)域，設(shè)計(jì)出針對(duì)PCV－2的特異性引物P1，P2一次性擴(kuò)增獲得了1800bp左右的目的片段。既克服了病毒細(xì)胞培養(yǎng)過程可能引入的污染，又避免了因病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性而進(jìn)行的多次反復(fù)傳代，同時(shí)一次擴(kuò)增克隆PCV－2全基因組還減少了分段擴(kuò)增克降所需的多次基因操作。PCR反應(yīng)擴(kuò)增克隆測(cè)定PCV－2－SC株序列，與GenBank中的13株參考序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，相似性介于95.2%～99.5%。PCV－2－SC分離株與本次比較的山東株（AY556473）親緣關(guān)系最近，相似性高達(dá)99.7%；與日本株（AY424401）相似性只有94.8%。但總體來說，不同分離株之間核苷酸水平的變異性比較小，各PCV－2分離株基因組之間總體上比較保守。但也存在著變異，變異的發(fā)生與地理位置和種豬來源不同有某種程度上的相關(guān)性。尹業(yè)師等[15]曾對(duì)2005年12月31日前GenBank中的253條PCV－2序列進(jìn)行同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上PCV－分為兩個(gè)亞型，其中亞型1是以分離自美國(guó)、加拿大、澳大利亞的毒株為代表，亞型2是以分離自法國(guó)和新西蘭的毒株為代表。本研究所分離的PCV－2序列與新西蘭代表株在同一分支，而與日本，加拿大和澳大利亞株不在同一分支，這說明本研究所得的流行毒株與新西蘭代表株親緣關(guān)系較近。本文的進(jìn)化樹分析表明國(guó)內(nèi)外的毒株均形成了幾個(gè)小的分支，表明不同地區(qū)的PCV－2分離株在基因組序列上存在一定的變異，可能存在地域上的相關(guān)性。

本研究是從一批典型PMWS的住群眾分離到的，且全基因組的與GenBank上已提交的序列相似性分析顯示，該毒株并不與國(guó)內(nèi)外已分離的任何一株序列完全相同，因此可認(rèn)為該毒株的分離鑒定具有地方的代表性。本研究成功分離到了PCV－2四川分離株，為進(jìn)一步從分子水平研究PCV－2在四川省的流行、變異規(guī)律以及主要結(jié)構(gòu)基因的特性等提供了參考數(shù)據(jù)，也為PCV－2的診斷及預(yù)防奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]柴少征，閆若潛，王東方，等.豬圓環(huán)病毒研究進(jìn)展 [J].畜禽業(yè)，2009（7）：34－36.

[2]Mankertz A，Domingo M，F(xiàn)olch J M，et al.Characterisation of PCV－2isolates from Spain，Germany and France[J].Virus Res，2000，66（1）：65－77.

[3]Onuki A，Abe K，Togashi K，et al.Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan[J].J Vet Med Sci Soci，1999，61（10）：1119－1130.

[4]Liu Q，Wang L，Willson P，et al.Seroprevalence of porcine circovirus type 2in swine populations in Canada and Costa Rica[J].Can J Vet Res，2002，66（4）：225－231.

[5]Mankertz A，Hillenbrand B.Analysis of transcription of porcine circovirus type 1[J].J Gene Virol，2002，83（11）：2743－2751.

[6]Allan G M，Mcneilly F，Ellis J，et al.PMWS：experimental model and co－infections[J].Vet Microbiol，2004，98（2）：165－168.

[7]Stevenson G W，Kiupel M，Mittal S K，et al.Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors[J].J Vet Diagn Invest，2001，13（1）：57－62.

[8]郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè) [J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2000（3）：3－5.

[9]周緒斌，張馨玉，許秀梅.我國(guó)豬圓環(huán)病毒2型的流行情況和分析 [J].中國(guó)豬業(yè)，2007（5）：37－41.

[10]Fenaux M，Halbur P，Haqshenas G，et al.Cloned genomic DNA of type 2porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs：characterization of clinical disease，virus distribution，and pathologic lesions[J].J Virol，2002，76（2）：541－551.

[11]Zhu Y，Lau A，Lau J，et al.Enhanced replication of porcine circovirus type 2（PCV－2）in a homogeneous subpopulation of PK15cell line[J].Virology，2007，369（2）：423－430.

[12]Opriessnig T，Madson D，Prickett J，et al.Effect of porcine circovirus type 2（PCV－2）vaccination on porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）and PCV－2coinfection[J].Vet Microbiol，2008，131（1－2）：103－114.

[13]徐紹建，李 俊，曹 帥，等.豬圓環(huán)病毒2型全序列分析及感染性克隆的構(gòu)建 [J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009（1）：21－23.

[14]溫永俊，吳國(guó)軍，蔡雪輝，等.豬圓環(huán)病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染對(duì)仔豬致病性的評(píng)估 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007（5）：336－340，493.

[15]尹業(yè)師.9株豬圓環(huán)病毒Ⅱ型流行毒株全基因組克隆及序列分析 [J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2007，26（2）：31－32.