張曉燕 蔣軍廣 翟展藝 鄭元元 劉瑞芬 張婧雯 楊 超 孫 曼

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

肺癌是當(dāng)前發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，在老年人群中高發(fā)。多項(xiàng)研究表明肺癌的發(fā)生不僅與原癌基因的激活、抑癌基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞增生過度和分化異常有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡異常有關(guān)。生存蛋白(Survivin)是凋亡抑制基因，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)探討Survivin的臨床生物學(xué)意義及在非小細(xì)胞性肺癌(NSCLC)的發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為NSCLC的早期診斷、治療和預(yù)后評估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 一般資料 2008年1月至2009年11月在我院胸外科手術(shù)切除且病理證實(shí)為NSCLC的肺癌組織標(biāo)本60例，男35例，女25例，年齡30～78〔平均(54±22.5)〕歲。鱗癌22例，腺癌38例，按組織學(xué)分級:高分化10例、中分化30例、低分化20例;按照2002年美國聯(lián)合癌癥分類委員會和國際抗癌聯(lián)盟制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;病理學(xué)或影像學(xué)檢查有胸膜轉(zhuǎn)移26例，無轉(zhuǎn)移34例。所有入選的肺癌病人術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。取20例NSCLC癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣大于3 cm并經(jīng)病理切片證實(shí)為正常的肺組織)作為對照。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)凋亡試劑盒購于美國Promega公司，植物過氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)換劑購自美國羅氏公司，兔抗人Survivin單克隆抗體、生物素-鏈霉親合素復(fù)合物(S-P)免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用S-P法，主要步驟:石蠟切片脫蠟水化，于檸檬酸緩沖液中行微波抗原修復(fù)，雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動(dòng)物血清封閉山羊血清阻斷非特異性反應(yīng)，滴加一抗兔抗人Survivin單克隆抗體，滴加生物素標(biāo)記的二抗，滴加S-P制劑，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測 采用TUNEL法，主要步驟:石蠟切片脫蠟水化，4%多聚甲醛固定，1∶500蛋白酶K工作液通透組織切片，4%多聚甲醛后固定，緩沖液平衡切片，加入孵育緩沖液標(biāo)記DNA斷裂鏈，載玻片浸入2倍檸檬酸緩沖液(SSC)終止反應(yīng)，熒光顯微鏡下分析樣品，加入POD轉(zhuǎn)換劑轉(zhuǎn)換，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.4 Survivin陽性結(jié)果判定及凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算 在200倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)有陽性細(xì)胞存在的視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共500個(gè)細(xì)胞。Survivin以胞質(zhì)/胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。判定方法:(1)按陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)評分:0分:0%，1分:＜10%，2分:10% ～50%，3分:＞50%。(2)按細(xì)胞染色深淺評分:無棕黃色顆粒，與背景無區(qū)別為0分;有棕黃色顆粒，明顯高于背景底色為1分;有染色較清晰的棕黃色顆粒，介于強(qiáng)弱之間為2分;有大量的深棕色顆粒，染色強(qiáng)為3分。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行判定，即(1)+(2):最后得分≥4分為陽性表達(dá)(+)，＜4分為陰性表達(dá)(-)。在40×10高倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察，計(jì)算凋亡細(xì)胞與所計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)的比值，即AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以x±s表示，采用χ2檢驗(yàn)的連續(xù)性校正及直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Survivin在NSCLC中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系Survivin主要定位于胞質(zhì)或胞核。60例NSCLC組織中Survivin的陽性表達(dá)率為46.7%(28/60)，20例正常肺組織的陽性表達(dá)率為10.0%(2/20)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.604，P=0.003)。Survivin在NSCLC患者高分化組中的陽性表達(dá)率低于中、低分化組，Survivin在臨床分期Ⅰ和Ⅱ期的陽性表達(dá)率低于Ⅲ和Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;而與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、病理分型、是否吸煙及有無胸膜轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。

2.2 Survivin與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系 Survivin分值0分、1～2分、3～4分、5～6分者 AI分別為4.49±1.60，3.78±1.53，2.58±0.88，1.45±0.46?？梢?，Survivin積分與 AI呈負(fù)相關(guān)(r=-0.736，P=0.000)。

表1 Survivin在NSCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的成員，在胚胎、胎兒組織中顯著表達(dá)在終末分化的成人組織如肝、肺、腦、脾、胰、腎、心臟、外周血白細(xì)胞、淋巴結(jié)及骨骼肌中則不表達(dá)(胸腺和生殖腺除外)〔1〕。隨著對該基因更深入的研究，人們發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤細(xì)胞中有Survivin的表達(dá)。Survivin抗凋亡的機(jī)制有以下幾種觀點(diǎn):(1)通過直接抑制終末效應(yīng)蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)和caspase-7，抑制caspase的活化和凋亡，從而抑制細(xì)胞凋亡〔2〕。(2)與輔助性線粒體源性caspase線粒體激活因子(SMAC)結(jié)合，進(jìn)而對抗甚至抑制caspase活性;同時(shí)，還可保護(hù)IAP的其他成員，如X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)免受SMAC的抑制而維持抗凋亡功能〔3〕。(3)間接作用于細(xì)胞周期依賴激酶4(CDK4)，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，引起p21的釋放，p21作用于 caspase-3前體，形成 procaspase-3/p21復(fù)合物，該復(fù)合物抑制了procaspase-3的激活，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的凋亡〔4〕。(4)與有絲分裂初期紡錘體的微管結(jié)合，間接抑制凋亡效應(yīng)因子caspase對紡錘體的水解，抑制細(xì)胞凋亡〔5〕。(5)通過非caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，如參與調(diào)節(jié)p53依賴的凋亡〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Survivin在胞質(zhì)、胞核著色或胞質(zhì)/胞核同時(shí)著色，偶見胞膜著色。在NSCLC中的表達(dá)明顯高于正常肺組織，提示Survivin的異常表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起到一定作用。Survivin有可能成為一種腫瘤標(biāo)記物，為肺癌的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

劉江偉等〔7〕報(bào)道，在胰腺癌中Survivin的陽性表達(dá)與病理學(xué)分級相關(guān)。Lu等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)與胃癌的分化程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示Survivin的表達(dá)有更高的惡性生物學(xué)意義，檢測Survivin有助于NSCLC惡性程度的判斷，Survivin陽性表達(dá)率越高，NSCLC惡性程度越高。Survivin在NSCLC臨床分期Ⅰ和Ⅱ期的陽性表達(dá)率低于Ⅲ和Ⅳ期，與劉紅菊等〔9〕報(bào)道的結(jié)果一致，檢測Survivin可能有助于臨床TNM分期。TNM分期作為一種臨床分期的標(biāo)準(zhǔn)，對腫瘤預(yù)后的判斷有相當(dāng)重要的價(jià)值，TNM分期愈晚，預(yù)示著腫瘤侵襲性愈高和預(yù)后不良，因此檢測Survivin可能有助于NSCLC預(yù)后的判斷。本研究發(fā)現(xiàn)Survivin在NSCLC組織中的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與張曉宇等〔10〕的研究一致。因此，檢測Survivin的表達(dá)可能有助于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷。

本實(shí)驗(yàn)表明Survivin積分與AI呈負(fù)相關(guān)。因此可以推論，Survivin在組織中的高表達(dá)抑制了突變的、多余的細(xì)胞發(fā)生凋亡，促進(jìn)了腫瘤的生長。但Survivin能否成為診斷NSCLC的腫瘤標(biāo)記物及判斷預(yù)后的有效指標(biāo)，還有待于更多的研究證實(shí)。

1 鮑曉蕾.凋亡相關(guān)基因PDCD5、Survivin在胃癌組織的表達(dá)及臨床意義〔D〕.吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

2 Ambrosini G，Adida C，Alteri DC.A novel anti-apoptosis gene，surviving，expressed in cancer and lymphoma〔J〕.Nature Med，1997;3(8):917-21.

3 Verhagen AM，Ekort PG，Pakusch M，et al.Identification of DIABLO，a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins〔J〕.Cell，2002;102(1):43-53.

4 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with CDK4 to resist Fas-mediated cell death〔J〕.Oncogene，2000;19(10):1346-53.

5 Deveraux QL，Takahashi R，Salvesen GS，et al.X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases〔J〕.Nature，1997;388(6639):300-4.

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7 劉江偉，李開宗，竇科峰.Survivin在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與p53的相關(guān)性研究〔J〕.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2003;24(6):417-9.

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9 劉紅菊，陶曉南，白 明，等.凋亡抑制基因survivin、bcl-2、bax在肺癌中表達(dá)的研究〔J〕.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2007;27(10):767-9.

10 張曉宇，鐘立厚，胡 克，等.生存素在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系〔J〕.中國肺癌雜志，2004;7(2):138-41.